Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen
Arrestin ~ hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy ... - JuSER
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ERGEBNISSE<br />
<strong>und</strong> am 3'Ende die Sequenzen fiir den Strep-TagH <strong>und</strong> eine EeoRI Sehnittstelle angehangt.<br />
Ais Template DNA diente del' Klon 9.13 (<strong>Arrestin</strong> im Vektor pGEX-4T-I, 3.1.1.1.). Das<br />
-1,2 kb PCR-Produkt wurde im Vektor pCR-Blunt zwisehenkloniert <strong>und</strong> dureh<br />
Sequenzierung verifiziert (Konstrukt LPCR7.12). Die Umklonierung in den<br />
<strong>Expression</strong>svektor pYEX-BX erfolgte tiber die EeoRI Sehnittstellen mit ansehlieBender<br />
Uberprufung del' Orientierung des Fragmentes dureh Sehneiden mit Restriktionsenzymen<br />
(Konstrukt 72.6). Das Konstrukt 72.6 wurde zur <strong>Expression</strong> in den S. cerevisiae Stamm Fll<br />
transformiert (Klon 72.6, <strong>Arrestin</strong>-Strep'I'agll),<br />
3.2.2.4. Konstruktion von <strong>Arrestin</strong>-GST im Vektor pYEX-BX<br />
Die hier besehriebene Klonierungsstrategie ist im Anhang sehematiseh dargestellt. Die im<br />
Text angegeben Nummern [1·10] beziehen sieh auf diese Darstellung.<br />
Die Fusionierung del' kodierenden Sequenzen von <strong>Arrestin</strong> mit den GST-Sequenzen wurde<br />
mittels PCR (2.7.4., Strategie C) unter Verwendung des Vektors 9.13 (<strong>Arrestin</strong> im Vektor<br />
pGEX-4T-l, 3.1.1.1., [1]) als Template durehgefiihrt. Es wurden jeweils parallel die<br />
PCR-Primer #14 <strong>und</strong> #16 bzw, #15 <strong>und</strong> #17 (2.7.6.1.) kombiniert <strong>und</strong> die PCR-Produkte<br />
diesel' Reaktionen [2] als Template del' Foige-PCR zusammen mit den PCR-Primern #15 <strong>und</strong><br />
#16 eingesetzt. Die Primer #14 <strong>und</strong> #17 wurden zueinander komplemcntar gewahlt <strong>und</strong><br />
dienten zur Einftlhrung del' Sequenzen fiir die Thrombinsehnittstelle. Del' Primer #15 befand<br />
sieh im Bereich del' XhoI Sehnittstelle (bei -750 bp) komplementar zur <strong>Arrestin</strong>sequenz, Am<br />
Ende von GST fiihrte del' Primer #16 eine EeoRI Restriktionssehnittstelle ein.<br />
Das entstandene -I,2kb PCR Produkt wurde in den Vektor pCR-Blunt kloniert (Konstrukt<br />
LPCR 32.1) [3]. Naeh Seqnenzierung wurde diesel' Vektor mit den Restriktionsenzymen<br />
EeoRI <strong>und</strong> XhoI gesehnitten <strong>und</strong> das entstandene -1,2 kb Fragment isoliert [3]. Parallel dazu<br />
wurde das Konstrukt LPCR8.16 (<strong>Arrestin</strong>-6His-Konstrukt in pCR-Blunt, [4]) mit den<br />
Enzymen EeoRI <strong>und</strong> Sail verdaut <strong>und</strong> das entstehende -800 bp <strong>Arrestin</strong>-Fragment isoliert<br />
[4]. Dieses Fragment wurde ansehlieBend in korrespondierende Sehnittstellen des Vektors<br />
pUC18 ligiert (Konstrukt 98.24, [5]). Del' Vektor 98.24 wurde nun mit XhoI <strong>und</strong> BeoRI<br />
verdaut, wobei ein -500 bp <strong>Arrestin</strong>-Fragment ausgesehnitten wurde [5]. Im Austauseh zu<br />
diesem -500bp Fragment wurde das aus dem Konstrukt LPCR32.1 gewonnene -1,2kb<br />
Fragment mit dem aufgesehnittenen Vektor 98.24 ligiert (Konstrukt 99.4, [6]). Del' Vektor<br />
pUCI8 enthalt nun die Fusion del' Gene von <strong>Arrestin</strong> <strong>und</strong> GST, wobei jedoeh die ersten<br />
-440 bp des <strong>Arrestin</strong>s fehlen. Zur Uberfuhrung del' Genfusion in den <strong>Expression</strong>svektor<br />
pYEX-BX wurde das -1,5 kb groBe EeoRIISall-Fragment in entspreehende Sehnittstellen des<br />
Vektors pYEX-BX ligiert (Konstrukt 100.1, [7]).
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