Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

DISKUSSION
Den zur Mutagenese ausgewahlten Aminosauren wird bislang im spezieIlen keine Funktion
zugeordnet. Dies ist neben del' raumlichen Zuganglichkeit entscheidend, da Mutanten mit
wildtypischem Verhalten erzeugt werden soIlen. Eine Abweichung vom wildtypischen
Bindungsverhalten der Mutanten soIl erst nach del' beschriebenen Biotinilierung durch
sterische Hinderung auftreten. Es wurden in jeder Kuppel zwei alternative Aminosauren
mutiert, urn im FaIle einer Abweichung vom wildtypischen Verhalten bei einer Mutaute auf
das alternative Protein ausweichen zu konnen,
In Untersuchungen konnte gezeigt werden, daB unter bestimmten Reaktionsbedingungen die
natlirlichen Cysteine (Cys 63, Cys 128 und Cys 143) zuganglich sind
(Pa1czewski et al., 1992b). Daher wurden diese nach Uberprtifung mit dem Programm
"Verify 3D" (Bowie et al., 1991) durch Serine ersetzt. In del' Raumstruktur von Arrestin sind
die Cysteine zwar nicht an del' Oberflache zu finden, jedoch kann dadurch eine
Zuganglichkeit genereIl nicht ausgeschlossen werden (J. Granzin, pers. Mitteilung). Bei dem
Versuch del' Reinigung von Arrestin-C-S-6His, Arrestin-S60C-6His und Arrestin-SI69C-6His
konnte kein losliches Protein isoliert werden, obwohl Expression del' rekombinanten Arrestin
Mutanten in Hefe-Gesamtzellextraktcn nachgewiesen wurde (3.4.3.). Lediglich fur das
Protein Arrestin-P352C-6His konnte keine Expression erreicht worden, was jedoch auf
Mutation oder Rekombination im Vektor pYEX-BX zuruckzufuhren ist, Durch erneute
HersteIlung des genetischen Konstrukts dieses Klons wird sich eine Expression erreichen
lassen.
Die bisher einzige, isolierte Arrestin Mutante ist Arrestin-V244C-6His. Dieses Protein konnte
mit einer Ausbeute von etwa 15 J.lg Protein pro Gramm ZeIlen gereinigt werden, dies
entspricht weniger als der Halfte einer Ausbeute an wildtypischem Arrestin (3.3.4.). Das
unterschiedliche Verhalten der Arrestin-Mutanten in Bezug auf ihre Loslichkeit laBt, unter del'
Berucksichtigung del' Erfahrung mit dem Protein p44 (3.4.4., 4.2.2.), die SchluBfolgerung zu,
daB die aliphatischen Serine in del' N-terminalen Domane (Ser 60, Ser 169) sowie auch die
Cysteine (Positionen Cys 63, Cys 128 und Cys 143) erheblich zur Stabilitat und Loslichkeit
von wildtypischem Arrestin beitragen. Die Cysteine bilden jedoch im nativen Arrestin keine
Cysteinbrlicken aus (Granzin et al., 1998). Der Austausch dieser Aminosauren hat
anscheinend eine grofsere destabilisierende Wirkung als die Substitution des Val 244 mit Cys,
Ein Reinigungsverfahren flir die Arrestin-Mutanten muB in zukiinftigen Experimenten noch
etabliert werden. Aufgrund des guten Resultats bei p44 nach Verwendung von Phosphatpuffer
beim ZeIlaufschluB (3.4.4., 4.2.2.) soIl diese Methode auch hier Anwendung finden. Bisher ist
jedoch noch nicht gezeigt, daB die bisher unloslich erscheinenden Mutanten sich wie das p44
unter Verwendung von Phosphatpuffer als loslich und stabil erweisen werden. Die
Untersuchung der Mutanten im nativen und biotinilierten Zustand mittels Zentrifugations­
Bindungs-Assays sowie PDE-Tests (Liebman & Evanczuk, 1982) soIl druber AufschluB
geben, ob Rhodopsin mit einer del' Kuppelinnenseiten interagiert oder sogar beide SteIlen
wichtig sind.