Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

INHALTSVERZEICHNIS
2.11. Isoelektrische Fokussierung 50
2.12. Massenspektrometrlsche Untersuchungen 50
2.12.1. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI-TOF-MS) 50
2.12.2. Elektro Spray Ionisierung (ESI-MS) 51
2.13. Edmann Abbau, N..terminale Protelnsequenslerung 51
2.14. Zentrlfugatiens-Blndungs..Assay 51
2.15. Kristallisationsmetboden 52
2.15.1. Kristallisation von wildtypischem Arrestin 52
2.15.1.1. Ermittlung del'optimalen Tropfen-Zusammensetzung 53
2.15.1.2. Kristallisationsansatze 53
2.15.2. Kristallisation von rekombinantem Arrestin 54
2.15.3. Auflosen von Kristallen fur analytische Zwecke 54
2.16. Kristallographiscbe Methoden 55
2.16.1. Messung von Rontgen-Beugungsdaten unter Kryo-Bedingungen 55
2.16.2. Praparation von Kristallen fur die Kryokristallographie 55
3.
3.1.
ERGEBNISSE 56
Uberexpression von Arrestin in Escherichia coli 56
3.1.1. Expression von Arrestin als N-terminale Glutathion-Ss'Iransfcrasc Fusion
im Vektor pGEX-4T-1 57
3.1.1.1. Klonierung von Arrestin in den VektorpGEX-4T-l 58
3.1.1.2. Expressionsbedingungen flir Arrestin irn Vektor pGEX-4T-1.. 58
3.1.1.3. ZellaufschluB und Reinigung des Fusionsproteins GST-Arrestin aus del'
Ioslichen Fraktion, sowie anschlieBende Isolation von Arrestin 59
3.1.2. Expression von Arrestin mit N-terminaler MRGS-6His Fusion im
Vektor pQE-30 63
3.1.2.1. KIonierung von Arrestin in den Vektor pQE-30 64
3.1.2.2. Expression und Reinigung von MRGS-6His-Arrestin im Vektor pQE-30 64
3.1.3. Expression von Arrestin mit C-terminaler StrepTagI Fusion im Vektor pASK7565
3.1.3.1. Klonierung von Arrestin-Strep'I'agl in den Vektor pASK75 66
3.1.3.2. Klonierung von ssompa-Arrcsttn-Strep'I'agl flir Sekretion ins Periplasma 67
3.1.3.3. Expression und Reinigung von Arrestin-StrepTagI.. 67
3.1.4. Zentrifugations-Bindungs-Assay zum Nachweis del' Funktionalitat von in E. coli
exprimierten Arrestinen 69
3.2. Uberexpresslon von Arrestin in Saccharomyces cerevisiae 71
3.2.1. Allgemeine Beschreibung des Vektors pEG-KT 72
3.2.1.1. Klonierung von Arrestin in den Vektor pEG-KT 73
3.2.2. Allgemeine Beschreibung des Vektors pYEX-BX 73
3.2.2.1. Konstruktion von MRGS-6His-Anestin im Vektor pYEX-BX 74