Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

N --=~:..:==-c-==~:..:= INHALTSVERZEICHNIS
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3.2.2.2. Konstruktion von Arrestin-6His im Vektor pYEX-BX 74
3.2.2.3. Konstruktion von Arrestin-Strep'Tagll im Vektor pYEX-BX 74
3.2.2.4. Konstruktion von Arrestin-GST im Vektor pYEX-BX 75
3.2.3. Auswahl des S. cerevisiae Expressionsstammes sowie del'
Expressionsbedingungen 76
3.2.3.1. Wachstumsverhalten verschiedener S. cerevisiae Stamme in Abhangigkeit von
Medium und Kohlenstoffquelle 77
3.2.3.2. Vergleich del' Arrestin-Exprcssionsratcn in Vollmedium sowie unter
Selektionsdruck in Minimalmedium 80
3.2.3.3. Ermittlung del' Kupfertoleranz des S. cerevisiae Stammes FlI 81
3.2.3.4. Die optimierten Expressionsbedingungen 82
3.3. Reinigung del' verschiedenen, in S. cerevisiae exprimierten
Arrestin-Fusionsproteine 83
3.3.1. ZellaufschluB von S. cerevisiae: EinfluB verschiedener Methoden auf die
Ausbeute an loslichcm Protein 83
3.3.2. Reinigung von Arrestin mit Modifikationen am N-Terminus nach Expression in
S. cerevisiae 84
3.3.2.1. Reinigung von GST-Arrestin mittels GST-Glutathion-
Affinitatschromatographie 84
3.3.2.2. Reinigung von MRGS-6His-AlTestin mittels !MAC 86
3.3.3. Arrestin mit Modifikationen am C-Terminus 87
3.3.3.1. Reinigung von Arrestin-6His mittels !MAC 87
3.3.3.2. Reinigung von Arrestin-Strep'I'agll libel' StrepTaktin-Sepharose 88
3.3.3.3. Reinigung von Arrestin-GST mittels GST-Glutathion-
Affinitatschromatographie 90
3.3.4. Ausbeuten del' verschiedenen Reinigungsverfahren 91
3.4. Arrestin Mutagenese 92
3.4.1. Austausch del' wildtypischen Cysteine von Arrestin gegen Serine 92
3.4.2. Austausch von Aminosliuren in den Kuppeln von Arrestin: Zielgerichtete
Mutagenese von Ser 60, Ser 169, Va1244 und Pro 352 93
3.4.3. Expression und Reinigung von Arrestin Mutanten 94
3.4.4. Expression del' SpleiBvariante von Arrestin p44 in S. cerevisiae 95
3.4.4.1. Klonierung von p44-Konstrukten in den Vektor pYEX-BX 95
3.4.4.2. Expression und Reinigung von p44 aus S. cerevisiae 96
3.5. Zentrlfugations-Blndungs-Assays ZUlli Nachweis del'Funktlonalltat von in
s. cerevisiae exprlmlerten Arrestinen 97
I. Untersuchung del' GST-Arrestin Fusion sowie aus GST-Arrestin isoliertes
Arrestin im Vergleich zum Arrestin aus dem Rinderauge 98