Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

56 ERGEBNISSE
3. Ergebnisse
Ziel del' Arbeit ist, durch heterologe Expression ein homogenes, wildtypisches Arrestin zu
erzeugen. Funktionalitat und Faltung des rekombinanten Proteins werden durch bioehemisehe
und biophysikalisehe Analysen kontrolliert, Dieses Protein ist die Basis fur die Erzeugung
von Mutanten, die in Anlehnung an die Rontgenstruktur entwickelt werden.
In del' vorliegenden Arbeit wurde das wt Arrestin am N- und C-Terminus verschieden
modifiziert und exprimiert, Diese Arrestine wurden nicht wie Arrestin aus dem Rinderauge
durch Bindung an Rhodopsin, sondern dureh Bindung tiber ihre Modifikation
affinitatschromatographisch gereinigt.
3.1. Uberexpresslon von Arrestin in Escherichia coli
AIs Wirtsorganismus ftlr heterologe Proteinexpression hat E. coli Vorteile wie z.B. sehneIIes
ZeIIwaehstum und sehr hohe Expressionsraten. Die kommerziell erhaltlichen
Expressionssysteme bieten die Moglichkeit Arrestin als Fusion an versehiedene
Affinitatspeptide oder Fusionspartncr zu erzeugen. Vorteil diesel' Art del' rekornbinanten
Proteinexpression ist die vereinfaehte Reinigung von Arrestin tiber Affinitatschromatographic.
Zusatzlich wird eine indirekte Detektion des heterolog exprimierten
Proteins im Westernblot tlber Antikorper bzw. spezifisehe Konjugate gegen den
Fusionspartner moglich, Ein weiterer Vorteil dieser Art del' Expression ist die Beeinflussung
del' Loslichkeit durch den Fusionspartner (La Vallie et aI., 1993).
Nachteile sind, daB einige Proteine nicht-bakteriellen Ursprungs nach Expression in E. coli
unlosliche Einschlulikorper, bestehend aus aggregiertem Protein, bilden. Viele eukaryotisehe
Proteine wie Arrestin werden in ihrem nattirlichen Witt post-translational prozessiert oder
modifiziert, nicht aber in E. coli. Diese Modifikationen beeinflussen oft die
Faltungsaktivitaten und die biologisehe Funktion del' Proteine. Ein EinfluB del' N-terruinalen
Aeetylierung von Arrestin auf die Faltung oder Funktion ist bislang unbekannt. FUr die
Erzeugung von nativ-eukaryotischen Proteinen ist aueh die Entfernung des N-terminalen
Methionins wichtig. In E. coli ist dies jedoeh abhangig von del' darauf folgenden Aminosaure
in der Polypeptidkette. Proteine wie Arrestin, mit Lysin an zweiter Position, behalten das
N-terminale Methionin (Sherman et aI., 1985). Zur Bildung von Proteinaggregaten kann aueh
die Tatsaehe beitragen, daB das Wirtseytosol keine geeignete Umgebung fur das Zielprotein
darsteIIt, Cysteinbrucken z.B, nieht moglich sind. Ebenso kann durch extreme
Uberproduktion die Loslichkeitsgrcnze JUr das jeweilige Protein tiberschtitten worden
(Mitraki & King, 1989).
Expressionsbedingungcn haben entseheidenden EinfluB auf die Loslichkeit des Zielproteins,
wobei Waehstumsrate, Expressionsrate und VOl' alIem die Temperatur wiehtige Faktoren sind