Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

124 ----===-=:::.:c::::.:c:-"-'--- DISKUSSION
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pH 7,5 konnte die ~-An'estin Ausbeute von etwa 50 f.lg Protein pro Gramm Zellen auf bis zu
2 mg Protein pro Gramm Zellen erhoht werden (U. Eidhoff, pel's. Mitteilung).
Dies bestatigte sich auch ftir das Protein p44 (3.4.4.). Dieses Protein ist bis Aminosaure 369
identisch zu Arrestin, die C-terminalen 35 Aminosauren 370 bis 404 sind durch ein Alanin
ersetzt, Im Vergleich zum wildtypischen Arrestin, das sich trotz pH-Anderung beim
ZellaufschluB von pH =7,5 in HEPES-Puffer auf pH - 5 in respektablen Mengen
(40 ug pro Gramm Zellen) isolieren liiBt, ist in S. cerevisiae exprimiertes p44 unter
gleichen Bedingungen dominant in del' unloslichen Fraktion. Nur ungefahr
3,5 ug p44 pro Gramm Zellen lassen sich isolieren. Diese Tatsache erscheint mit dem
Hintergrund del' Literaturdaten zunachst nicht ungewohnlich, p44 wird als
membranassoziiertes Protein beschrieben (Palczewski et al., 1994a, b; Smith et al., 1994), ist
in Losung relativ instabil und neigt stark zur Prazipitation (A. Pulvermuller, pers. Mitteilung).
Palczewski und Mitarbeiter fanden, daB der fehlende C-Terminus einen erheblichen EinfluB
auf die Loslichkeit des Proteins hat (Palczewski et al., 1994a). Zunachst wurde dies auch
durch die Expression in Hefe bestatigt (3.4.4.2. Abb. 3.17.). Der Wechse1 des
ZellaufschluBpuffers resultierte jedoch in etwa 1 mg pro Gramm Zellen isolierbarern,
Ioslichem Protein, welches nach Umpufferung im Puffer 10/400 gute Stabilitat zeigte. Die
Vermutung liegt nahe, daB bei ZeIlaufschluB mit HEPES-Puffer trotz 400 mM NaCI das p44
an die Membranen von S. cerevisiae assoziiert. Im Vergleich zum wildtypischen Arrestin ist
p44 sensitiver auf Schwankungen des pH-Wertes. Durch theoretische Berechnungen des
pI-Werts und del' pH-abhiingigen Gesamtladung von Arrestin und p44 (Internet-Programm am
EMBL, Heidelberg) wird deutlich, daB der Isoelektrische Punkt der beiden Proteine urn fast
3 pH-Einheiten voneinander abweicht. Arrestin ist ungeladen bei pH 6,03, p44 bei pH 8,85.
Das aus S. cerevisiae gereinigte p44-Protein wurde bisher noch nicht im Zentrifugations­
Bindungs-Assay oder PDE-Test untersucht.
Es ist anzunehmen, daB sich die Ausbeute del' verschiedenen Arrestine durch Verwendung des
beschriebenen Phosphatpuffers entsprechend zu ~-Arrestin und p44 auf etwa 2 mg pro
Gramm Zellen erhohen WBt. Dieser Puffer halt vor allem beim ZeIlaufschluB den pH-Wert
von 7,5 konstant, dies ist auch im Hinblick auf Proteaseaktivitat relevant, da ein niedriger
pH-Wert Proteaseinhibitoren inaktivieren kann (Jones 1991).
Da das in diesel' Arbeit entwickelte, heterologe Expressionssystem fill' retinales Arrestin auf
das homologe ~-Arrestin ubertragen werden konnte, ist es wahrscheinlich, daB sich daber aIle
Proteine der Arrestin-Familie erfolgreich in S. cerevisiae exprimieren lassen. Die
verschiedenen Proteine del' Arrestin-Familie zeigen in ihrer Primarsequenz groBe Homologie.
Es lassen sich 5 hoch konservierte Bereiche (Fingerprint-Regionen, Motive I bis V; 1.5.)
definieren (Granzin et al., 1998; 1.5.). Lediglich die Familie der ~-Arrestine enthalt zusatzlich
im C-terminalen Bereich eine konservierte Clathrin-Bindestelle (Krupnick et al., 1997;
Hirsch et al., 1999). So besteht z.B. fur medizinische Studien nun die Moglichkeit, groBe
Mengen von humanem Arrestin aus Stabchen wie auch aus Zapfen (X-Arrestin) herzustellen.