resúmenes de ponencias - Asociación Española de Biopatología ...

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FORMAS CLÁSICAS DE HIPERPLASIA SUPRARRENAL CONGÉNITA:
ANÁLISIS COMPLEMENTARIO DEL CRIBADO DE MUTACIONES
PUNTUALES RECURRENTES
SANTOMÉ COLLAZO, L.; CIRUJANO SEGURA, A.; SÁNCHEZ BERDIAL, S.;
MUÑOZ-PACHECO , R.; EZQUIETA ZUBICARAY, B.;
Hospital General Universitario Gregorio Marañón - Madrid
Las formas clásicas de hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) por déficit de 21hidroxilasa
(21-OHD) se deben mayoritariamente a mutaciones recurrentes que
surgen por procesos de recombinación desigual o conversión génica entre el gen de la
21-OHD (CYP21A2) y su pseudogén (CYP21A1) dispuesto en tándem. El panel de
cribado molecular para las diez mutaciones más frecuentes resuelve, mediante
técnicas de hibridación específica de alelo (ASO) y PCR, hasta el 85% de los alelos
de las formas clásicas neonatales. Aunque infrecuentes, existen formas severas que
resultan negativas en este cribado limitado (Ezquieta et al 2000). El diagnóstico de
sospecha de la HSC clásica se establece normalmente en base a datos clínicos y
bioquímicos neonatales, aunque se incluyen también en algunas CCAA casos
procedentes del cribado neonatal.
En el presente estudio se describen tres casos en los que una aproximación más
exhaustiva por southern-blot y análisis indirecto de microsatélites (en región HLA)
permitieron, respectivamente, detectar el alelo no amplificable portador de deleción
en heterozigosis y sospechar la consanguinidad no conocida; que orientaron sobre el
interés de realizar una secuenciación complementaria, permitiendo el conjunto del
análisis llegar al diagnóstico definitivo.
Caso 1: Niña con hipertrofia de clítoris y fusión de labios mayores, diagnosticada de
una forma virilizante simple (VS) y discreta pérdida salina en la que se encontró una
mutación en homozigosis G291S detectada por secuenciación y análisis indirecto de
microsatélites e identificada en heterocigosis en los padres. Caso 2: Niña con forma
pierde sal (PS) y virilización grado Prader III-IV que resultó hemizigota por deleción
en el alelo paterno y presentó la mutación R483fr. Caso 3: Varón de 10 días de origen
ecuatoriano con forma PS, único paciente en nuestra serie que resultó heterocigoto
compuesto para dos mutaciones raras (C169fr/Q262X), que fueron identificadas en
heterocigosis en los progenitores.
Aunque el panel de cribado molecular de mutaciones puntuales muestra una
excelente cobertura de la mayoría de formas clásicas, en ocasiones se muestra
insuficiente y se hace necesario un análisis complementario que llegue a una
caracterización genotípica definitiva. Además, resulta de gran interés disponer de esta
herramienta molecular de confirmación, ya que los datos perinatales de los
metabolitos suprarrenales pueden mostrar tanto interferencias bioquímicas como
interacciones fisiológicas.
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PORTADORES DE MUTACIONES GRAVES DE HSC POR DEFICIENCIA
21-HIDROXILASA EN POBLACIÓN GENERAL Y REPRODUCCIÓN
ASISTIDA
SÁNCHEZ BERDIAL, S.; CIRUJANO SEGURA, A.; ÁLVAREZ APARICIO, E.;
MUÑOZ-PACHECO ROMAN, R.; GARCÍA GONZALEZ, M.; EZQUIETA
ZUBICARAY, B.;
HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑON - MADRID
Introducción: La hiperplasia adrenal congénita es una enfermedad autosómica
recesiva (en el 95% de los casos debida a un déficit de 21 hidroxilasa, 21OHD) que
en su forma neonatal o clásica presenta una frecuencia de 1:10.000-1:15.000. La
virilización de sus formas severas puede ser prevenida mediante tratamiento prenatal.
Muchas parejas con problemas de infertilidad se someten a técnicas de reproducción
asistida (TRA) sin previa realización de estudios genéticos. Recientemente hemos
descrito (Ezquieta et al Fértil Steril, 2007) 5 casos de HSC que habían sido el
resultado de tres situaciones de riesgo que no habían sido valoradas: donación de
óvulo ó espermatozoide con mutación clásica, fertilización homóloga en familias
consanguíneas y pareja en que uno de los progenitores presentaba infertilidad por una
forma no clásica con mutación severa. En esta comunicación presentamos una nueva
situación de riesgo que no fue prevenida: una niña con una forma clásica virilizante
concebida por TRA en pareja no consanguínea.
Paciente Y Métodos: Paciente (1 año) con hipertrofia del clítoris que había sido
interpretada como sinequia vulvar, inicio de pubarquia y maduración ósea avanzada.
Padres jóvenes, no consanguíneos y aparentemente sanos. En el estudio bioquímico
se encontró una 17OH progesterona basal de 48 ng/ml, también aumentados los
niveles de DHEA y androstenodiona. Se realizó el estudio molecular a la paciente y a
sus progenitores. Las deleciones y duplicaciones fueron analizadas por Southern y las
mutaciones puntuales por PCR e hibridación específica de alelo. Ambos con
detección quimioluminiscente (Digoxigenina y CSPD). La deleción de 8pb se detectó
en minigeles nativos de acrilamida. Se realizo el tipaje de microsatélites (PCR con
marcaje fluorescente) para determinar la segregación de alelos.
Resultados: La paciente presenta una forma virilizante simple (VS) de 21OHD. El
estudio molecular mostró que es heterocigota compuesta para mutaciones graves. El
padre es portador de Ile172Asn (mutación con actividad residual 1-2% típica de VS),
y la madre es portadora de una conversión grande del gen que incluye la zona 5` llega
hasta el exón 4.
Discusión: Este caso constituye un nuevo ejemplo de la importancia de realizar
consejo genético y diagnóstico molecular a las parejas que van a someterse a TRA,
dada la alta frecuencia de portadores de 21OH. La paciente podría haber sido tratada
de forma prenatal y así, haber evitado la virilización que presenta.
I Congreso Nacional del Laboratório Clínico – Sevilla, 17/20 Octubre 2007
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EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS PARA EL GENOTIPADO DE LA
APOLIPOPROTEÍNA E
GUTIÉRREZ AGULLÓ, M.; CHACÓN CASTRO, P.; SOLÉ LLOP, E.;
Hospital Vall D'hebron - Barcelona
Objetivo
El gen de la Apolipoproteína E presenta tres posibles alelos e2, e3 y e4 que difieren
en la presencia de C o T en los codones 112 y 158 del exón 4. La presencia de unos u
otros alelos está asociada a diferentes patologías como Alzheimer y riesgo
cardiovascular. En nuestro laboratorio utilizamos el kit INNO-LiPA ApoE basado en
hibridación reversa y la hemos comparado con un ensayo (SNP Genotiping assay de
Applied) para PCR a tiempo Real con el fin de disminuir tiempo de respuesta y
costes.
Material Y Método
El sistema INNO-LiPA ApoE se basa en la hibridación del DNA amplificado y
biotinilado con sondas específicas para los polimorfismos en las posiciones 112 y
158, inmovilizadas en una membrana. El protocolo se realizó siguiendo las
indicaciones establecidas por Innogenetics.
Los ensayos para SNPs de Applied biosystems, uno para el 112 y otro para el 158 se
realizaron siguiendo el protocolo de amplificación de Applied. Para la amplificación
a tiempo real se utilizó el RotorGene 6000 de Corbett con el análisis “Scatterplot
Analysis” del software de la máquina, que realiza el genotipaje en base a la relativa
amplificación detectada en dos canales y definida en base a regiones en el scatterplot.
Resultados
Se estudiaron 21 muestras en total y las coincidencias entre las dos técnicas fueron
del 100%.
El estudio de costes por paciente con el INNo-LiPA Apo E es de unos 25 euros y
mediante los SNPs Genotiping Assay para Real Time es de 3.7 euros.
Conclusiones
La utilización del sistema de PCR a tiempo real permite acortar de forma significativa
el tiempo de respuesta, ya que se pueden tener los resultados en 24 horas. El estudio
económico de costes y tiempo demostró que aunque las dos técnicas son robustas y el
genotipaje se realiza de forma correcta, la utilización de sondas Taqman abarata
mucho los costes, tanto económicos como de tiempo, así como de la cantidad de
DNA de partida.
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POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL CD14 Y IL-1RA Y GRAVEDAD DE
LA SEPSIS
SUAREZ SANTAMARIA, M.; PEREZ RAMIREZ, A.; MILENA ABRIL, A.; DIEZ
FUENTES, M.; MEDINA VEGA, L.; SANTOLARIA , F.;
Laboratorio Del Hospital Universitario De Canarias - La Laguna
Los polimorfismos de algunos genes que codifican a los mediadores de la
inflamación se han relacionado con una predisposición y pronóstico de la sepsis
Objetivo.Análisis del valor pronóstico de los polimorfismos del IL-1ra y del receptor
CD14 en pacientes con sepsis y su relación con los mediadores de la inflamación, la
reacción de fase aguda y disfunción de órganos.
Método.Se estudiaron 246 pacientes(edad media de 62.8 ± 1.1 años; 103 mujeres y
143 varones)hospitalizados y diagnosticados de sepsis por 2 o más criterios SIRS
junto a evidencia de infección.Fallecieron durante el ingreso 55(22.4%)
Al ingreso, 40(16.3%)tenían sepsis,111(45.1%)sepsis grave, 72(29.3%)shock séptico
y 23(9.3%)FMO.Se determinaron las citocinas proinflamatorias: TNF, IL-6 y
TREM1 y antiinflamatorias: IL-10 e IL1ra,CD14, LBP y reactantes de fase aguda:
alfa1antitripsina,ferritina y PCR. La disfunción órganos y gravedad se valoraron
mediante el SOFA. Se determinaron el genotipo de los polimorfismos C-159T del
CD14 y la secuencia de repeticiones del segundo intrón del IL-1ra en todos los
pacientes y en 100 controles.
Resultados.La distribución de los polimorfismos C-159T del CD14 y del IL-1ra es
similar en pacientes y controles por lo que no se pueden relacionar con una
predisposición a la sepsis.El polimorfismo TT del CD14 tenía una menor
mortalidad(12.3%)respecto a los CC o TC(25.6%)p =0.042; RR: 2.45(1.09-5.5).Sin
embargo no encontramos relación con las concentraciones del CD14 o de otros
mediadores de la inflamación, así como tampoco con la gravedad de la sepsis o la
disfunción de órganos.Los enfermos con el polimorfismo IL-1RN2/2 tenían una
mayor mortalidad,47.6% frente al resto de pacientes,20%,p =0.009; RR: 3.64(9.1-
1.45).Se obtienen resultados similares en pacientes con formas graves de sepsis.El
polimorfismo IL-1RN2/2 se relaciona también con una peor evolución y
empeoramiento del SOFA en el 2º y 3º día de evolución. No encontramos relación
con las concentraciones del IL-1ra, ni con las de otros mediadores. Por otra parte,el
polimorfismo IL-1RN2/2 tiene una escasa representación en la población(8.1%)por lo
que contribuye poco a la predicción general de los pacientes con sepsis.El
polimorfismo TT del CD14(C-159T)se asocia con una menor mortalidad mientras
que el IL-1RN2/2 del IL-1ra se asocia con una mayor mortalidad.No encontramos
una mayor representación de los polimorfismos desfavorables en sepsis respecto a los
controles, por lo que no podemos hablar de predisposicion