INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

- Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave.- Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentracióndeseada.2. Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51 Cr: La relaciónentre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco ycélulas efectoras (por ej. 1:50).- Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco (noolvidar los controles).- Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC por 4hs en estufa gaseada con CO 2 al 5%.- Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador decentelleo.• Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas):En los cultivos de células blanco (sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del51 Cr fijado durante la marcación.• Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):A los co-cultivos de células efectoras + células blanco se agrega un detergente (Tritón X-100)que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación total del 51 Crfijado durante la marcación.•• Cálculo del porcentaje de lisis específica:(cpm experimentales – cpm espontáneas)Lisis específica = X 100(cpm máximas - cpm espontáneas)Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba seaválida.En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL),correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o el50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras:células blanco.Pruebas para determinar citotoxicidad de células Natural Killer (NK)La actividad NK se mide generalmente en ensayos de liberación de 51 Cr, utilizando unametodología similar a la utilizada para linfocitos T citotóxicos.Si la evaluación se realiza en seres humanos, se utiliza como células blanco una línea celulardenominada K562 que son células tumorales humanas.Cuando se realiza la evaluación en un sistema murino, generalmente se utilizan como célulasblanco las células de la línea Yac 1, que provienen de un linfoma murino inducido por el virusMoloney. Como fuente de células efectoras se utiliza una suspensión celular de bazo.Para evaluar la actividad NK en perros se utiliza una línea celular de adenocarcinoma canino,CTAC.En todos los casos, la metodología utilizada es similar a la descripta para linfocitos Tcitotóxicos.Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpoClínicamente, el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectorasinmunocompetentes, por ejemplo, en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico.Otra aplicación importante de la CCDA es la evaluación de anticuerpos contra aloantígenos,células tumorales o virus. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los pacientes querecibirán un trasplante o que padecen una infección viral.A continuación se describe un método para medir actividad efectora de CCDA en célulasmononucleares de sangre periférica, empleando células blanco marcadas con 51 Cr.115