INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

gradiente de concentración. En la interfase líquido-gel no se forma precipitado debido a la altaconcentración antigénica en esta zona. La precipitación aparece en forma de bandas en lazona donde la concentración del antígeno que ha difundido es la óptima. Si en el suero haymás de un anticuerpo y en la solución añadida hay más de un antígeno que se correspondan,se formarán tantas bandas de precipitación como sistemas hayan interaccionado. Difusión bidireccionalEn este caso ambos reactivos (antígeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sinreactivos) por diferencias de concentración y forman el enrejado (precipitación visible) en lazona en la cual se encuentran la mayor concentración de complejos inmune asociados.MÉTODO: Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 ºC) y el antisuero conespecificidad contra el antígeno en estudio. Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción, y enfriarlo rápidamente para que solidifique. Inmediatamente después, añadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50 ºC.Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno.Después de la solidificación, dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horasconvenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2) Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partículas antigénicas difundendesde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En el punto de encuentro seforma la banda de precipitado. Difusión simple en placa, Inmunodifusión radial o técnica de ManciniEste método ha dado magníficos resultados para la cuantificación de antígenos. Cuandoun antígeno es colocado en un orificio practicado en una placa de agar, éste difunde en formaradial. Si en la matriz del agar hay anticuerpos monoespecíficos, el antígeno que difundeformará complejos inmunes con los anticuerpos disueltos en el agar. Esta reacción se observacomo un halo de precipitación.De acuerdo a los principios básicos de la difusión, el diámetro del halo de precipitación estaráen relación directa con la concentración de antígeno. Si esta operación se repite colocando endiferentes orificios de la placa cantidades variables y conocidas del antígeno en estudio (porejemplo, diluciones en base 2) y se incuba hasta que el halo de precipitación no se modifique,se puede confeccionar una recta con los resultados obtenidos, en la que se relaciona eldiámetro de cada círculo de precipitación (X) con la correspondiente concentración antigénica(Y). Esta recta permite calcular la concentración de ese mismo antígeno en cualquier muestradesconocida, estableciendo el diámetro del halo de precipitación de la muestra problema. Laconcentración de la muestra podrá determinarse luego por simple cálculo o por interpolación apartir de la curva de calibración.La difusión radial se utiliza con muy buenos resultados para la valoración de proteínas que seencuentran presentes en mezclas complejas como por ejemplo los componentes del suero.Es indispensable disponer para ello de anticuerpos específicos contra cada uno de losantígenos que se quiere valorar.MÉTODO: Añadir 5-10 % del suero específico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y enfriado a50ºC, procurando que la mezcla sea lo más homogénea posible. Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta susolidificación. Mediante un sacabocados, efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que deben estarsituados a distancias convenientes entre sí para evitar interferencias. (Se necesita un orificiopara cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para las distintas concentraciones delantígeno patrón que se utilizan para la elaboración de la recta de calibración). En uno de los orificios de la placa, colocar 2 microlitros de la solución antigénica a valorar(muestra problema), o una dilución conveniente de esta solución.83