INMUNOLOGÃA BÃSICA â CURSADA 2012 La InmunologÃa estudia ...

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9. Kent, U.M. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. Methods inMolecular Biology Vol 115: 23-28.10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods inMolecular Biology. Vols 147: 1-6.Proteínas del plasma y sueroLa sangre está compuesta por células (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y plasma.Cuando se extrae sangre venosa con anticoagulantes, los elementos celulares en suspensiónpueden ser separados por centrifugación. El sobrenadante que se obtiene, denominado plasmasanguíneo, posee un 10% de solutos disueltos, compuestos a su vez por un 2 % de nutrientesorgánicos y sustancias de desecho, un 1% de sales inorgánicas y un 7% de proteínasplasmáticas.Si por el contrario dejamos que la sangre extraída coagule y luego la centrifugamos,obtendremos lo que denominamos suero, que no posee fibrinógeno ya que es el precursor dela fibrina, proteína formadora del coágulo sanguíneo y se consume durante la coagulación. Elsuero contiene las mismas proteínas del plasma excepto el fibrinógeno y los factores V y VIII dela coagulación que son consumidos durante la formación del coágulo. El fibrinógeno, precursorde la fibrina, es producido por el hígado y constituye el 4 – 6 % de las proteínas totales delplasma.Si se somete un suero a una corriente eléctrica y bajo determinadas condiciones(electroforesis) las proteínas del suero se distribuyen en diferentes fracciones, a saber:*Albúminas: es la proteína más abundante del suero, varía según la especie entre un 35 y 50%de las proteínas totales. Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimientodel volumen (equilibrio osmótico). Además es transportadora de sustancias poco solubles enagua (ej: ácidos grasos libres).*Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy complejaque se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1, alfa-2, beta y gamma1. -1 globulinas:• Glicoproteínas• Globulina fijadora de tiroxina• Protrombina• Antitripsinas• HDL (lipoproteína de alta densidad)2. -2 globulinas:• Factor IX• Antiplasmina• Haptoglobina• Ceruloplasmia• Amiloide A• VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad)• LDL (Lipoproteína de baja densidad)3. -globulinas:• Transferrina• Fibrinógeno• Factores del Complemento• Proteína C reactiva36
• Amiloide A• Ferritina• Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domésticas.4. Fracción globulinas:• IgM• IgA• IgE en concentraciones ínfimas• IgGCada especie posee un perfil electroforético caracteristico, a modo de ejemplo se muestran losValores Normales en suero para caninosProteínas Totales 5.50 - 7.50 g/dlAlbúminas2.47 - 3.60 g/dl Globulinas 0.66 - 1.57 g/dl Globulinas 1.04 - 2.17 g/dl Globulinas 0.33 - 0.75 g/dlRelación A/G 0.70 - 1.20ElectroforesisSe conoce como electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de uncampo eléctrico. Cuando una mezcla de moléculas que presentan diferente carga neta ytamaño es colocada en un campo eléctrico uniforme, migran a distintas velocidades. Comoresultado, ocurre la separación de estas sustancias.La velocidad de migración de una sustancia en un campo eléctrico depende de varios factorestales como la carga, el tamaño de la partícula, el pH, la fuerza iónica, la viscosidad del medio yademás, la temperatura e intensidad de la electricidad.Las proteínas y los aminoácidos poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia degrupos ionizables como el grupo carboxilo o el grupo amino, lo que hace que en una soluciónse comporten como anfolitos. Así, dependiendo del pH de la solución, pueden existir en tresformas iónicas:*Cargados positivamente*Cargados negativamente*Sin carga o como moléculas neutras (en una solución con pH igual a su punto isoeléctrico).El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en elcual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la proteína no migra cuandose la somete a la acción de un campo eléctrico. El PI es inherente a la estructura primaria de laproteína, pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena polipeptídica. Por lo tanto, adeterminado pH, distintas proteínas con distinto punto isoeléctrico tendrán distinta carga neta,lo que permitirá separarlas e identificarlas por medios electroforéticos.J. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar loscomponentes del suero. Existen dos métodos generales para separación de proteínas porelectroforesis:• electroforesis libre o de frente móvil, que se realiza en una fase líquida, y• electroforesis de zona, que utiliza una matriz sólida o soporte, como el papel de filtro,membranas de acetato de celulosa o geles de almidón, poliacrilamida, agar o agarosa. Estosmateriales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas.De ambas, la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicación en el laboratorio clínicopor su sencillez y mayor capacidad de resolución. Para la separación de las proteínas delsuero, por ejemplo, se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge un37
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