INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

9. Bradshaw BJ, Edwards S. Antibody isotype responses to experimental infection with bovineherpesvirus 1 in calves with colostrally derived antibody. Vet Microbiol 1996 Nov;53(1-2):143-51.10. Balázs Mayer, Zsuzsanna Kis, Gyózó Kaján, László V. Frenyó. The neonatal Fc receptor(FcRn) is expressed in the bovine lung. Vet Immunol. Immunopathol. 98 (2004) 85 – 89.11. Yaofeng Zhao, Imre Kacskovics, Zhihui Zhao. Presence of the di-leucine motif in thecytoplasmic tail of the pig FcRn α chain. . Vet Immunol. Immunopathol. 96 (2003) 229 – 233.12. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.InmunoelectroforesisLa técnica de inmunoelectroforesis combina la electroforesis y la inmunodifusión en gelde agar. El primer paso es la separación de los componentes de la mezcla antigénica porelectroforesis en gel de agar. Si se usa una solución amortiguadora alcalina, la mayoría de lasproteínas se cargarán negativamente y migrarán hacia el ánodo (polo positivo). Algunasmoléculas como las gammaglobulinas, que poseen un punto isoeléctrico (PI) muy cercano alpH de la solución amortiguadora utilizada, migran hacia el cátodo (polo negativo) debido alfenómeno conocido como movimiento electroendosmótico. Este efecto es producido porque elagar en un medio alcalino tiene carga negativa, lo que hace que el agua se carguepositivamente y migre hacia el cátodo arrastrando las moléculas que se encuentran ensolución, sobre todo las que no tienen carga o poseen carga baja.Una vez terminada la separación electroforética, se coloca el antisuero en un canal cortado enel agar, paralelo a la dirección de la migración electroforética.Durante el período de incubación, los antígenos que fueron separados electroforéticamente ylos anticuerpos del antisuero se desplazan en el gel de agar hasta encontrarse (al igual que enla inmunodifusión doble), para producir una banda o línea de precipitación. Cada línea deprecipitación representa la reacción de un antígeno con su respectivo anticuerpo.Materiales necesarios:-Cuba de electroforesisPortaobjetos limpios y desengrasadosCámara húmedaAgar nobleSolución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorarProcedimiento1- Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada capade impregnación, contiene una solución de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de soluciónamortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solución, se cubre el portaobjetos tratandode formar una delgada capa y luego se deja secar.2- Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posiciónhorizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Se dejagelificar a temperatura ambiente.3- Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otraestrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación circular.4- En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria desolución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado secolocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución utilizando tirasde papel de filtro previamente humedecidas con la solución amortiguadora (uno de losextremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solución amortiguadora).5- Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10 voltios/cm. degel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.120