INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en unapoblación heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarseusando FSC y SSC.Fluorescencia:Un compuesto fluorescente absorbe energía de cierto rango de longitud de onda que escaracterístico para ese compuesto. Esta absorción de luz provoca que un electrón de lasustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energía. El electrón así excitado decae enenergía emitiendo el exceso como un fotón. Esta transición de energía se denominafluorescencia. Cuanta más energía es consumida en la absorción, más energía es emitida en lafluorescencia.- El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce comosu espectro de absorción.- El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisión.El láser de argón es comúnmente usado en citometría debido a que su longitud de onda de 488nm puede excitar más de un fluorocromo. Entonces, se puede usar más de un fluorocromosimultáneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisión seencuentren lo suficientemente alejados entre sí.La combinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen estecriterio. La magnitud de la señal detectada es proporcional al número de moléculas defluorocromo en la partícula.En una mezcla de células se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerposmonoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. El tipo de tinción captadapor cada subpoblación junto con la FSC y SSC, pueden ser usadas para identificar qué tiposcelulares están presentes en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas.Filtros ópticos:Una vez que la partícula pasó a través del láser, la SSC y la señal fluorescente emitidasvan al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de undetector para una tinción fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro quepermite que sólo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector.Detección de señales:Los fotodetectores convierten las señales de luz en señales eléctricas. La intensidad delas señales eléctricas es proporcional a la intensidad de las señales de luz.Cuando la partícula se interpone en el haz de láser y comienza a desviar la luz o producirfluorescencia, se crea un pulso. El punto más alto de este pulso ocurre cuando el rayo incidesobre el centro de la partícula y se capta el máximo de luz desviada o fluorescencia emitida. Amedida que la partícula se aleja del rayo, el pulso baja a la línea de base.Una vez que las señales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un númeroproporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente eléctrica mayor. Lacorriente eléctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulsodepende del número de fotones detectados por el fotomultiplicador.3-Sistema electrónico: recolección de datos.Las señales de luz se convierten finalmente en señales electrónicas, lo que permite que losdatos puedan guardarse en una computadora.Pero cómo se define la muestra a tomar?Adquisición de las muestras:Se denomina así a la toma de muestra por parte del citómetroQué tipo de datos guardará la computadora, dependerá de los parámetros que previamenteestablezca el operador. Estos parámetros varían de acuerdo con las muestras a analizar.74