INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una uniónestable entre matriz y ligando.En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacárida, en su mayoría derivados de laagarosa. Debido a su estructura química, estas matrices tienen la característica de ser casiinertes, de forma que no producen interacciones inespecíficas. Esto es esencial porque lacromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas.La selección del ligando utilizado en cromatografía de afinidad debe tener en cuenta:1- que la afinidad de unión del ligando sea específica y reversible por la sustancia que serápurificada.2- que el ligando posea grupos químicamente modificables que permitan su unión a la matrizsin que se destruya su capacidad de unión a la sustancia que será purificada.Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, éste se va a unir a la matriz a través de su porciónFc, y por lo tanto, quedará libre el sitio de unión al antígeno. Al agregar un antígeno, éste seráreconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las demás moléculaspresentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado.Posteriormente, el antígeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en formapura.El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10 -4 a 10 -8 M -1 en solución. Sila constante de disociación es mayor que 10 -8 M -1 esta técnica no puede ser utilizada para lapurificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomoléculadel ligando se hace muy difícil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacciónhormona-receptor para lo cual este método no resulta útil.Ejemplos:Purificación por columna de proteína A-sepharosa:La proteína A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene laparticularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado proteínas similaresen otras bacterias (por ejemplo proteína G en Streptococcus sp.). Aunque se desconoce laexplicación biológica de la fuerte afinidad que tienen la proteína A y la proteína G con lasmoléculas de IgG, se supone que representaría un mecanismo de escape de las bacterias a larespuesta inmune del huésped. A partir del estudio de estas proteínas, se las comenzó autilizar para purificar específicamente anticuerpos a partir de una muestra impura.La proteína A se acopla a una matriz de sepharosa activada.En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las proteínas A y G con anticuerpos de diferentesespecies:Tabla 2Especie Afinidad por Proteína A Afinidad por proteína GHumano ++++ ++++Caballo ++ ++++Vaca ++ ++++Cerdo +++ +++Oveja +/- ++Cabra - ++Conejo ++++ +++Hamster + ++Pollo - +Cobayo ++++ ++Rata +/- ++Ratón ++ ++Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold SpringHarbor Laboratory. 1988. pp726.31