INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

Metodología:1. Sensibilización y marcación de las células blanco:- Se lavan las células tres veces con medio de cultivo. Antes del último lavado se dividen endos alícuotas iguales.- A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido previamentecalentando a 56ºC por una hora, procedimiento que inactiva los factores del complemento.A la otra alícuota se la toma como control sin suero.- Se agrega dicromato de sodio marcado ( 51 Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min.- Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo noincorporado.2. Medición de la actividad de CCDA por un ensayo de liberación de 51 Cr:- Se prepara una suspensión de células efectoras, se hacen diluciones seriadas (1:2, 1:4,1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los correspondientes controles.- Se agregan células blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51 Cr.- Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las células y se incuban a 37ºCpor 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO 2 al 5%.- Luego de la incubación, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y selevanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo líquido. Las cpmdeterminadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la rupturacelular.Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):A los co-cultivos de células efectoras + células blanco recubiertas con anticuerpos y célulasefectoras + células blanco sin recubrir con anticuerpos, se agrega un detergente (Tritón X-100)que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación de 51 Cr.Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas):A los cultivos de células blanco recubiertas con anticuerpos y células blanco sin recubrir conanticuerpos (ambos sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del 51 Cr fijadodurante la marcación.Cálculo del porcentaje de lisis específica:(cpm experimentales – cpm espontáneas)Lisis específica = X 100(cpm máximas - cpm espontáneas)El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas poranticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje deCCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas conanticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir.Bibliografía1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral bloodleukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Iºmmunology andImmunopathology. 45: 85-952. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introducción a la Inmunología Humana. 387 pp.3. Margni, R.A. 1996 Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp.4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal ofLeukocyte Biology. 57: 548-5525. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cellmediatedcytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22.116