INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

Métodos de Aislamiento y purificación1-a PrecipitaciónLas interacciones de una proteína en agua ocurren entre las moléculas de proteína-agua yproteína-proteína. Cuando predominan las interacciones proteína-agua, éstas se hallan ensolución; cuando predominan las segundas (proteína-proteína), éstas precipitan. Cuando a unaproteína que se encuentra en solución acuosa agregamos una sal, como la sal es máshidrofílica que la proteína, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen lasinteracciones proteína-proteína. Por lo tanto, la proteína precipita.Es importante considerar el pH de la solución de trabajo: Cuando el pH de la solución esigual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la carga neta de dicha proteína es cero y por lotanto sus moléculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar consulfato de amonio a 4ºC: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto secumple para el rango de 0 a 40ºC.En resumen, los factores que afectan la concentración salina a la cual una proteína enparticular precipitará son:1- el número y la posición de los grupos polares;2- el peso molecular de la proteína a purificar;3- el pH de la solución;4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitación. Precipitación salinaLa precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicasdel suero. Las sales mas comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas nia temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentración de sal a la cualprecipitan los anticuerpos varía según la especie. Por ejemplo, la mayoría de los anticuerposde conejo precipitan con una solución saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratónnecesitan entre 40-50%. Precipitación con ácido caprílicoLa adición al suero de ácidos grasos de cadena corta como el ácido caprílico encondiciones medianamente ácidas, precipita la mayoría de las proteínas con excepción de lasIgGs. Esta metodología, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se larealiza en combinación con otras metodologías (por ejemplo, cromatografía de intercambioiónico).1-b CromatografíaLa característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fasesmutuamente no miscibles (una móvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestraa purificar se introduce en la fase móvil, por lo que es transportada a lo largo de una columnaque contiene la fase estacionaria homogéneamente distribuida. Los diferentes componentes dela muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria.Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en función de su interaccióncon la fase estacionaria: el componente que menos interactúa es el menos retenido y eluyeprimero, el que más interactúa resulta retenido más fuertemente y eluye último. Una separaciónóptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye ensegundo término es retenido lo suficiente como para impedir su superposición con elcomponente que eluyó en primer término.Las macromoléculas biológicas difieren en sus características fisicoquímicas: tamaño,forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructuratridimensional. La separación de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entrelas propiedades fisicoquímicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Eslógico, por lo tanto, que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación deestas moléculas sean:28