INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2012 La Inmunología estudia ...

Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos. Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz.La marcación de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones quellevan a la formación de uniones covalentes entre ellos y las moléculas de inmunoglobulinas.Esta unión se hace a pH alcalino. Además, la conjugación entre ambas moléculas depende dela temperatura y del tiempo de reacción.Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados queemiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay muchofluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcación inespecífica.Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminoácidos de losanticuerpos, particularmente de la lisina. Es importante entonces que los buffers usados para laconjugación no tengan grupos aminos (tris, azida, glicina, amonio, etc).El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el fluorocromo más usado para la conjugación conanticuerpos. Produce una muy buena señal de color verde, que se diferencia notablemente dela autofluorescencia generalmente más amarillenta y pálida de los tejidos. La fluoresceína esmuy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisión se obtiene a pH 8-9. El inconvenientemás importante es que pierde color rápidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantenganlas improntas teñidas hay que tener la precaución de guardarlas envueltas en papel dealuminio y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposición a la luz.Microscopio de fluorescenciaEl microscopio de fluorescencia consta de:- el microscopio óptico- una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta- un sistema de filtros:a) El primer filtro es el de excitación o selección de luz, ubicado entre la fuente de luz y elpreparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en elrango azul, con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul yproduzca emisión de luz fluorescente.b) El segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitaciónen los microscopios de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en losmicroscopios de luz incidente.c) El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianosque podrían ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejodicrómico.Preparación de los reactivos:Obtención de los anticuerpos:Se obtienen mediante inmunización en animales. Las inmunoglobulinas se aplican en 2 ó 3inyecciones a intervalos de 3 a 4 semanas. El suero se recoge 7 a 10 días luego de la últimainyección. La respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos.Concentración del Anticuerpo:Se logra mediante precipitación con soluciones saturadas de sales de amonio. Los anticuerposprecipitados pueden permanecer en solución salina de fosfatos (PBS) a pH 7.1.Conjugación:Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de sueroluego de concentrar los anticuerpos. Se debe añadir al suero buffer carbonato-bicarbonato paramantener condiciones óptimas de pH (9.0). Se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromoen un período de 15 minutos, Luego se mantiene el preparado en heladera toda la noche, enagitación, ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.Purificación del conjugado:Se logra mediante la eliminación por diálisis de las sales del buffer y de los elementos utilizadoscomo solventes del fluorocromo (acetona) que podrían dañar al conjugado. Además se utilizaextracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar los restos defluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tinción inespecífica.71