UNIVERSITA' DI ROMA “LA SAPIENZA” - Padis

More documents

Recommendations

Info

3.3 Espressione e purificazione di proteine salivari L’espressione e la purificazione delle proteine salivari sono state eseguite dal Dott. Raffaele Ronca del Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, Università Federico II di Napoli. Sia la procedura di espressione che di purificazione sono riportate in dettaglio in Rizzo et al., 2011. 3.4 ELISA La tecnica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), che consente di rivelare complessi antigene-anticorpo, è stata impiegata per verificare la presenza di anticorpi contro le tre proteine salivari: gSG6 e l’anofelina di An.gambiae e gSG6 di An.funestus. L’adsorbimento è stato effettuato depositando 50 µl di antigene diluito in coating buffer (15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, 3mM NaN3, pH 9.6) sul fondo dei pozzetti di una micropiastra da 96 (Nunc, Multiwell immune plate Maxisorp, M9410 ). Dopo un’ incubazione over night a 4°C è stato eseguito un lavaggio con PBST (1x PBS, 0.05% Tween 20) e altri tre con acqua distillata per allontanare l’eccesso di antigene non legato. Successivamente, al fine di saturare i siti liberi, si è provveduto ad una incubazione di 3 ore a temperatura ambiente con 150 µl di blocking buffer [1% (w/v) latte in polvere (Marvel) in PBS-T] seguita da altri 4 lavaggi con PBST e acqua distillata. La reazione antigene-anticorpo è stata fatta avvenire aggiungendo in ciascun pozzetto 50 µl di siero diluito in Blocking buffer. Ciascun siero è stato testato in duplicato e in un terzo pozzetto senza antigene. Le piastre sono state incubate overnight a 4°C e quindi lavate di nuovo con PBST e acqua distillata per eliminare l’eccesso di anticorpi non legati. La rilevazione del complesso antigene-anticorpo è stata effettuata mediante incubazione per 3 ore a temperatura ambiente con 100 µl di anticorpo secondario diluito in Blocking buffer. Dopo aver effettuato 3 lavaggi con PBST si è provveduto all’aggiunta di 100 µl di o- phenylenediamine dihydrochloride (OPD Sigma #P8287) in 0.05 M di soluzione citrato- fosfato (pH 5.0) contenente H2O2. Dopo 15 minuti di incubazione al buio e a temperatura ambiente la reazione colorimetrica è stata bloccata mediante l’aggiunta di 25 µl di H2SO4 2M. A questo punto la presenza del complesso antigene-anticorpo è stata quantificata mediante lettura della piastra a 492 nm. Nella Tab. 4, sono riportate le concentrazioni degli antigeni e le diluzioni di anticorpi primari e secondari utilizzati per ciascun esperimento. 44
Ig Antigene [Ag] Diluzione AbI Diluzione AbII IgG IgG1 IgG4 Anofelina gSG6 An. gambiae 10 µg/ml * 1:100 gSG6 An. funestus 10 µg/ml 1:100 gSG6 An. gambiae + gSG6 An. funestus 5 µg/ml + 5 µg/ml 1:100 gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20 gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20 Anofelina An. gambiae 5µg/ml 1:100 1:5000 Anti human-IgG HRP (Dako P0214) 1:5000 Anti human-IgG HRP (Dako P0214) 1:5000 Anti human-IgG HRP (Dako P0214) 1:1000 Anti human IgG1 e IgG4 (Binding Site AP006) 1:1000 Anti human IgG1 e IgG4 (Binding Site AP009) 1:5000 Anti human-IgG HRP (Dako P0214) Tabella 4 Concentrazioni degli antigeni e diluzioni dei sieri utilizzati nelle diverse indagini sperimentali ([Ag]= Concentrazione antigene; Ab I= anticorpo primario; Ab II= anticorpo secondario; * nell’analisi comparativa con l’anofelina la concentrazione di gSG6 utilizzata per il coating era di 5 µg/ml). 3.5 Analisi statistica I livelli di anticorpi IgG anti gSG6, espressi come OD finali, sono stati calcolati per ciascun siero come il valore medio della densità ottica per i pozzetti con l’antigene a cui è stato poi sottratto il valore OD senza antigene. Quando il coefficiente di variazione nei duplicati dei sieri è risultato superiore al 20% questi sono stati esclusi dall'analisi. La variazione intra e inter-specifica del saggio è risultata al di sotto del 20% dei valori medi dei controlli. La soglia di sieropositività è stata calcolata come media delle densità ottiche dei sieri di controllo +3 deviazioni standard. Le differenze stagionali dei livelli di IgG sono state calcolate mediante il test non parametrico di Kruskal-Wallis corretto con il Dunn’s post test per comparazioni multiple. Le differenze dei livelli anticorpali tra gruppi indipendenti è stata effettuata con il test di Mann-Whitney. Le comparazioni di frequenze sono state 45
Page 1 and 2: UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZ
Page 3 and 4: 3.5 Analisi statistica ............
Page 5 and 6: 1.2 I protagonisti della malattia D
Page 7 and 8: zuccherini di origine vegetale. Le
Page 9 and 10: meridionale; P. malariae e P. ovale
Page 11 and 12: produrrà altri merozoiti, in numer
Page 13 and 14: 1.4 Clinica L’esito della malatti
Page 15 and 16: zone temperate era strettamente col
Page 17 and 18: Figura 1.7 Una delle misure di lott
Page 19 and 20: parallelo delle conoscenze sulla fa
Page 21 and 22: Vi sono infatti alcune fondamentali
Page 23 and 24: altri). Inoltre, la stima dell’EI
Page 25 and 26: 1.6.2.3 Capacità vettrice La capac
Page 27 and 28: dell’immunità acquisita dell’i
Page 29 and 30: isposta anticorpale della durata di
Page 31 and 32: Figura 1.11 Immagini al microscopio
Page 33 and 34: longipalpis aumenta considerevolmen
Page 35 and 36: protein or protein family1 comment
Page 37 and 38: Figura 1.13 Effetto della deplezion
Page 39 and 40: negativamente (D8, D13, E14, D18, D
Page 41 and 42: diverse gSG6, così come all’anof
Page 43: Figura 3.1 Area di studio Il campio
Page 47 and 48: 4 Risultati e discussioni 4.1 Espre
Page 49 and 50: A B Figura 4.4 (A) Analisi della fr
Page 51 and 52: del 58,5% (p=0,01) e del 94,5 % (p=
Page 53 and 54: Figura 4.8 Distribuzione dei valori
Page 55 and 56: differenza nel titolo anticorpale t
Page 57 and 58: Figura 4.12 Livelli di OD nei respo
Page 59 and 60: e 1995) si assiste ad un aumento si
Page 61 and 62: contatto cellulare e/o produzione d
Page 63 and 64: 110% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 3
Page 65 and 66: Ago ‘96 Ott ‘96 M 0,414 (23) F
Page 67 and 68: anticorpale diminuisce gradualmente
Page 69 and 70: Fase 2: in pochi giorni, e dopo alt
Page 71 and 72: Figura 4.22 Andamento stagionale de
Page 73 and 74: emerge che le IgG4 sono associate a
Page 75 and 76: Figura 4.25 Stratificazione dei liv
Page 77 and 78: anni con un picco intorno ai 5 anni
Page 79 and 80: 10 kDa UN MW IN Figura 4.28 Analisi
Page 81 and 82: OD OD OD 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.
Page 83 and 84: Figura 4.33 Confronto stagionale de
Page 85 and 86: OD 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
Page 87 and 88: Inoltre, dalla Fig. 4.37 si deduce
Page 89 and 90: combinato di gSG6 e anofelina, poss
Page 91 and 92: completamente in accordo con l’ip
Page 93 and 94: 6 Bibliografia Aalberse, R. C., S.
Page 95 and 96:
medical Books Ltd. Bruce-Chwatt, L.
Page 97 and 98:
De Carneri, I. (1997). Parassitolog
Page 99 and 100:
mosquitoes." Bulletin Institut Past
Page 101 and 102:
protein." Am J Trop Med Hyg 61(4):
Page 103 and 104:
e2472. Pouvelle, B., R. Spiegel, et
Page 105 and 106:
Shaukat, A. M., J. G. Breman, et al
Page 107:
107
show all

UNIVERSITA' DI ROMA “LA SAPIENZA” - Padis

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?