UNIVERSITA' DI ROMA “LA SAPIENZA” - Padis

UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZA”
DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE DI SANITÀ
PUBBLICA E MICROBIOLOGIA
CURRICULUM: MICROBIOLOGIA E PARASSITOLOGIA
CICLO: XXIII
RISPOSTA IMMUNITARIA UMANA AD ANTIGENI
SALIVARI DI ANOPHELES: POSSIBILE UTILIZZO QUALI
MARCATORI DI ESPOSIZIONE A VETTORI MALARICI
CINZIA RIZZO
DOCENTI GUIDA COORDINATORE
DOTT. BRUNO ARCÀ PROF. GIANFRANCO TARSITANI
PROF. DAVID MODIANO

Indice
1 Introduzione ...................................................................................................................... 4
1.1 La Malaria e i vettori ................................................................................................... 4
1.2 I protagonisti della malattia ......................................................................................... 5
1.2.1 L’uomo .................................................................................................................. 5
1.2.2 Il vettore ................................................................................................................ 6
1.2.3 Il plasmodio ........................................................................................................... 7
1.3 Ciclo biologico ............................................................................................................. 9
1.3.1 Il plasmodio nell’uomo: ciclo esoeritrociario ..................................................... 10
1.3.2 Il plasmodio nell’uomo: fase eritrocitaria ........................................................... 10
1.3.3 Il plasmodio nell’Anofele: fase sporogonica ...................................................... 11
1.4 Clinica ........................................................................................................................ 13
1.5 Strategie e bersagli nella lotta antimalarica ............................................................... 14
1.6 Epidemiologia ............................................................................................................ 20
1.6.1 Vettore idoneo ..................................................................................................... 20
1.6.2 Indici entomologici di trasmissione .................................................................... 22
1.6.2.1 Tasso di Inoculazione Entomologica ............................................................ 22
1.6.2.2 Tasso di Riproduzione di Macdonald ........................................................... 23
1.6.2.3 Capacità vettrice ........................................................................................... 25
1.6.2.4 Indice di stabilità .......................................................................................... 25
1.6.3 Indici parassitologici di trasmissione .................................................................. 26
1.6.4 Indicatori sierologi di trasmissione ..................................................................... 28
1.7 Interazione zanzara-ospite ......................................................................................... 30
1.7.1 Le ghiandole salivari e la saliva .......................................................................... 30
1.7.2 Risvolti applicativi dello studio sulle ghiandole salivari .................................... 32
1.7.3 gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6) .......................................................... 36
1.7.4 Anophelin/cE5 ..................................................................................................... 38
2 Scopo della tesi ................................................................................................................ 40
3 Materiali e Metodi .......................................................................................................... 42
3.1 Area di studio e popolazione ..................................................................................... 42
3.2 Osservazioni entomologiche ...................................................................................... 43
3.3 Espressione e purificazione di proteine salivari ........................................................ 44
3.4 ELISA ........................................................................................................................ 44
2

3.5 Analisi statistica ......................................................................................................... 45
4 Risultati e discussioni ..................................................................................................... 47
4.1 Espressione e purificazione di gSG6 di An. gambiae ................................................ 47
4.2 Densità anofeliche nei due villaggi campionati ......................................................... 49
4.3 Analisi della risposta IgG anti- gSG6 di An. gambiae ............................................... 51
4.3.1 Immunogenicità di gSG6 .................................................................................... 51
4.3.2 Variazione del titolo anticorpale in accordo alla stagione di trasmissione ......... 53
4.3.3 Risposta anticorpale alla proteina salivare gSG6 nei due gruppi etnici: Mossi e
Fulani ............................................................................................................................ 56
4.3.4 Variazione del titolo anticorpale con l’età .......................................................... 61
4.4 Analisi delle sottoclassi IgG1 e IgG4 anti- gSG6 di An. gambiae ............................ 70
4.4.1 Variazione stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4................................................. 70
4.4.2 Differenze inter-etnica dei livelli di IgG1 e IgG4 ............................................... 73
4.4.3 Variazione dei titoli di IgG1 e IgG4 con l’età ..................................................... 74
4.5 Analisi comparativa della risposta IgG alla proteina salivare gSG6 di Anopheles
funestus e di Anopheles gambiae ..................................................................................... 78
4.5.1 Espressione e purificazione di gSG6 di Anopheles funestus ............................... 78
4.5.2 Immunogenicità di gSG6 di An.funestus ............................................................. 80
4.5.3 Variabilità stagionale della risposta a gSG6 di An.funestus ................................ 82
4.5.4 Confronto della risposta anticorpale ai tre marcatori .......................................... 82
4.6 Analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare: anofelina ............................ 84
4.6.2 Immunogenicità dell’anofelina ........................................................................... 84
4.6.3 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina e a gSG6 di An. gambiae ..... 85
4.6.4 Differenze di sensibilità tra anofelina e gSG6 .................................................... 87
5 Conclusioni ...................................................................................................................... 90
6 Bibliografia ...................................................................................................................... 93
3

1.1 La Malaria e i vettori
1 Introduzione
Definita "mal’aria" in seguito alla credenza popolare che venisse trasmessa dai miasmi
delle paludi, la malaria, insieme alla tubercolosi e all’AIDS, rappresenta oggi una delle
principali emergenze sanitarie al mondo. Valutare la reale diffusione di questa parassitosi
in maniera accurata è molto difficile a causa della sintomatologia, molto simile a quella di
altre malattie infettive, e della mancanza di un controllo assoluto sui decessi che nella
maggior parte dei casi avviene in casa, senza ricovero ospedaliero. Nonostante ciò,
secondo i dati dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2008 sono stati
stimati circa 250 milioni di casi di malaria in tutto il mondo. Di questi la maggior parte si
verifica nelle regioni Africane (85%), a cui fanno seguito il Sud-Est Asiatico (10%) e le
regioni orientali del Mediterraneo (4%). E’ a rischio di malaria oltre il 40% della
popolazione che vive in più di 100 aree endemiche del mondo, situate nella fascia tropicale
e sub-tropicale del pianeta (Africa Sub-Sahariana, Asia ed America del Sud) (Fig. 1.1).
Inoltre, sono stati stimati circa 850.000 decessi per malaria, di cui l’89% si verifica
nell'Africa sub-sahariana, e la maggior parte di questi avvengono tra i bambini al di sotto
dei cinque anni di età (World Malaria Report, WHO 2009).
Figura 1.1 Distribuzione mondiale del rischio di trasmissione di malaria
(World Malaria Report, WHO 2009)
4

1.2 I protagonisti della malattia
Da sempre la diffusione della malaria è stata influenzata da un intreccio di fattori che ha
come protagonisti i tre organismi coinvolti nel ciclo di trasmissione: l’uomo, la zanzara e il
plasmodio. Le recenti conoscenze scientifiche hanno permesso di chiarire quali siano le
basi di tale relazione, e identificare in che modo fattori quali la biologia e il
comportamento di una specie di Anopheles, la biologia dei plasmodi, fattori ambientali,
caratteristiche genetiche, socio economiche e culturali della popolazione abbiano
condizionato la diffusione della malattia.
1.2.1 L’uomo
La malaria è una malattia antichissima, da sempre legata alla storia dell'Uomo.
Reperti archeologici indicano che la malaria era già presente a partire dal III- IV millennio
a.C. I cambiamenti introdotti dall’uomo nell’ambiente nel corso della sua storia
influenzarono la diffusione delle zanzare vettrici e dei plasmodi da esse trasmessi,
causando ripercussioni spesso considerevoli sullo sviluppo delle civiltà umane. Il
passaggio da una società composta da cacciatori-raccoglitori ad una di coltivatori segnò
una svolta nell’epidemiologia della malaria: le forme più gravi della malattia comparvero
infatti solo con l’emergere delle prime organizzazioni sedentarie, tra 5.000 e 10.000 anni fa
(Coluzzi, 1999). Abbattendo le foreste per coltivare i campi, l’uomo creò le condizioni per
la diffusione di quelle anofeli che deponevano le uova in piccole raccolte di acqua
soleggiate e alcune specie, come Anopheles gambiae in Africa, avrebbero sviluppato una
stretta associazione con l’uomo diventando particolarmente efficaci nella trasmissione dei
plasmodi umani. Il salto tecnologico-culturale legato allo sviluppo agricolo determinò una
eccezionale disponibilità alimentare, determinando un picco di crescita demografica delle
comunità umane. Ciò ha condizionato fortemente l’epidemiologia della malaria,
permettendo una costante diffusione della malattia negli insediamenti umani. Le successive
migrazioni e guerre tra diverse civiltà, così come le esplorazioni e gli scambi commerciali,
favorirono infine la diffusione della malaria dai suoi primi focolai africani ed asiatici alle
regioni europee e, in ultimo, nelle Americhe (Corbellini G, 1998). Da un punto di vista
socio-economico, la malaria è al tempo stesso causa e conseguenza di povertà: numerose
nazioni africane non hanno a disposizione infrastrutture e risorse necessarie per
organizzare campagne antimalaria sostenibili (Sachs and Malaney, 2002). Inoltre, lo
sviluppo economico in paesi con alta trasmissione di malaria è stato storicamente più basso
5

ispetto ad altre nazioni. La malaria ha anche un grande impatto sulle risorse umane delle
regioni colpite: non solo i suoi effetti si esprimono in morti premature ma, nei soggetti che
sopravvivono ad un attacco grave, si hanno inoltre danni neurologici, in genere sub clinici
e permanenti che spesso sono causa di ridotte capacità cognitive. Di conseguenza, la
mancata produttività a causa della malattia e della morte prematura, così come gli ostacoli
all'educazione dei bambini e allo sviluppo sociale, determinano un quadro sfavorevole per
lo sviluppo di queste nazioni. Ciò significa che gran parte del potenziale intellettuale di
queste popolazioni viene perso, contribuendo fortemente al mancato sviluppo culturale ed
economico che, a loro volta, alimentano la malattia instaurando un drammatico circolo
vizioso.
1.2.2 Il vettore
Le zanzare vettrici della malaria umana, dal punto di vista sistematico sono insetti
olometaboli appartenenti all’Ordine Diptera, Famiglia Culicidae, Sottofamiglia
Anophelinae, Genere Anopheles (Fig. 1.2).
Figura 1.2 Anopheles gambiae
(http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/09262002/00008/A.gambiae.1354.p_lores.jpg)
La famiglia Culicidae comprende più di 3000 specie raggruppate in Sottofamiglie di cui le
principali sono le Anophelinae e Culicinae. Queste, oltre a svolgere la loro attività di
ectoparassiti ematofagi, comprendono specie di enorme rilevanza per la medicina umana e
veterinaria in quanto vettori di Virus, Protozoi e Nematodi parassiti. La femmina, dopo
essere stata fecondata, inizia l’attività di ectoparassita ematofago, alla ricerca di ospiti
vertebrati da pungere per poter portare a termine lo sviluppo delle uova e la conseguente
ovodeposizione. I maschi invece, non sono ematofagi e si nutrono esclusivamente di succhi
6

zuccherini di origine vegetale. Le femmine di Anopheles depongono le uova generalmente
in raccolte d'acqua stagnante. Dopo un paio di giorni le uova schiudono liberando piccole
larve acquatiche che respirano aria atmosferica mediante un paio di spiracoli posti
sull’addome. Dopo 4 stadi larvali, si sviluppa una pupa da cui si forma l'insetto adulto. In
media i maschi vivono pochi giorni, mentre le femmine due o più settimane. Dal punto di
vista morfologico, i culicidi presentano un capo con due grandi occhi composti e dotato di
due antenne allungate costituite da 15 segmenti. Nei maschi tali antenne sono assai visibili
e presentano un aspetto piumoso, sono infatti coperte da setole piuttosto lunghe. Nelle
femmine le antenne risultano assai meno appariscenti, essendo ricoperte da setole
nettamente più corte. I pezzi boccali dell’apparato pungente-succhiante di questi insetti
consistono di un’epifaringe, un’ipofaringe, due mandibole e due mascelle modificate in 4
stiletti adattati alla perforazione della cute dell’ospite. Il dotto salivare è costituito da un
sottile canale addossato all’ipofaringe, mentre il canale alimentare in cui scorre il sangue
prelevato dall’ospite è formato da epifaringe ed ipofaringe unite tra loro. Tutti questi pezzi
formano un fascicolo che durante la puntura va ad infilarsi nel vaso sanguigno. Il fascicolo
è contenuto all’interno della guaina morbida con funzione protettiva formata dal labbro
inferiore (labium). Questa, durante il pasto di sangue, si piega a formare un’ansa,
permettendo così al fascicolo di penetrare nell’ospite. Al capo segue il torace, suddiviso in
protorace, mesotorace e metatorace. Le ali si inseriscono nel mesotorace, mentre i bilanceri
nel metatorace. Ogni segmento toracico, inoltre, porta un paio di zampe pentarticolate.
L’addome è lungo e sottile e termina con un apparato copulatore nell’ultimo segmento
addominale.
1.2.3 Il plasmodio
La malaria è causata da Protozoi appartenenti al Phylum Apicomplexa. Questo Phylum
comprende circa 5000 specie di parassiti endocellulari caratterizzati dalla presenza di un
complesso apicale coinvolto nell’invasione cellulare e di un apicoplasto, un organello con
quattro membrane simile al plastidio derivante da un evento endosimbiontico secondario.
Quest’organello è coinvolto nel metabolismo lipidico e nella formazione del vacuolo
parassitoforo. Inoltre, risulta essenziale per la sopravvivenza del parassita in quanto la sua
distruzione previene l’invasione di nuove cellule dell’ospite. Il complesso apicale
comprende vescicole citoplasmatiche, roptrie e micronemi, che secernono proteine di
adesione ed enzimi litici coinvolti nell’invasione cellulare. Inoltre, è presente un conoide
7

con al suo interno dei microtubuli a forma di serpentina, che permettono la motilità e la
penetrazione all’interno della cellula ospite (Fig. 1.3).
Figura 1.3 Rappresentazione schematica di un parassita
protozoo appartenente al Phylum degli Apicomplexa (Ajioka
et al., 2001)
Si suppone che la storia evolutiva dell’agente eziologico della malaria, il plasmodio,
preceda di milioni d’anni la comparsa dell’uomo. Una delle ipotesi più accreditate a tal
riguardo suppone che il plasmodio discenda da parassiti delle cellule intestinali di gorilla
(Cohen, 2010). Molto probabilmente, questi si propagavano attraverso la produzione di
sporocisti emesse con le feci e in grado di resistere nell’ambiente esterno. Adattatisi a
vivere nelle cellule degli organi interni e poi nel sangue, i parassiti dovettero trovare un
sistema differente per passare da un ospite all’altro, adottando, come vettore, un insetto
succhiatore di sangue quale la zanzara.
Attualmente si conoscono quasi 200 specie di plasmodi che infettano, oltre all’uomo e agli
altri primati, anche i roditori, gli uccelli e i rettili, appartenenti in tutti i casi alla Classe
Sporozoa, Ordine Eucoccidiida, Famiglia Plasmodiidae Genere Plasmodium. Le quattro
specie di Plasmodi in grado di parassitare l’uomo (Plasmodium falciparum, P. vivax, P.
ovale e P. malariae) hanno cicli sostanzialmente simili; le principali differenze si
riferiscono alla velocità dei processi moltiplicativi, al numero di parassiti prodotti in ogni
fase di replicazione e alla patogenicità per l’uomo. Tuttavia, recentemente nel Borneo
malaysiano, sono stati riportati dei casi di malaria umana trasmessi da P. knowlesi, un
parassita che causa la malaria nei macachi (Singh et al., 2004). Queste specie presentano
una distribuzione variabile: P. falciparum è principalmente diffuso nell’Africa sub-
sahariana; P. vivax, invece, è maggiormente presente in Asia, America centrale e
8

meridionale; P. malariae e P. ovale sono molto meno frequenti in Africa. Inoltre, P. ovale è
distribuito anche in Papua Nuova Guinea e nelle Filippine (Tab 1)(Carter and Mendis,
2002).
1.3 Ciclo biologico
Tabella 1 Distribuzione delle specie di Plasmodium nel mondo
(Carter and Mendis, 2002)
Come accennato precedentemente, la malaria umana è una malattia infettiva
causata da quattro specie di protozoi con cicli dixeni in cui l’ospite intermedio è l’uomo e
l’ospite definitivo è una zanzara appartenente al genere Anopheles. L'Uomo contrae la
malattia in seguito alla puntura infettante della zanzara, che a sua volta si è infettata
pungendo una persona nel cui sangue circolavano gli stadi infettanti del parassita.
Lo sviluppo del parassita prevede il passaggio attraverso le seguenti fasi (Fig. 1.4):
ciclo esoeritrocitario;
ciclo eritrocitario;
ciclo sporogonico.
Figura 1.4 Ciclo biologico di Plasmodium falciparum (Pasvol, 2010).
9

1.3.1 Il plasmodio nell’uomo: ciclo esoeritrociario
L’infezione nell’uomo inizia quando una femmina di zanzara infetta punge l’uomo
per compiere il pasto di sangue iniettando nel sistema circolatorio, insieme alla saliva, il
parassita allo stato di sporozoita. Gli sporozoiti raggiungono quindi il parenchima epatico e
invadono gli epatociti. Qui si accrescono in trofozoiti consumando poco a poco la cellula
ospite. Dopo circa una settimana i trofozoiti si moltiplicano per schizogonia,
trasformandosi in schizonti, in cui si divide il nucleo ma non il citoplasma. Quindi, dopo
un periodo di maturazione che va dai 5 ai 12 giorni, a seconda delle specie di Plasmodio, lo
schizonte maturo dà origine a migliaia di merozoiti unicellulari che, a questo punto, sono
in grado di abbandonare il fegato e infettare direttamente gli eritrociti nel torrente
sanguigno. Nel caso l’infezione sia dovuta a P. falciparum o P. malariae, dopo la fase
schizogonica epatica inizia direttamente la fase ematica del ciclo. Questa modalità diretta
può provocare “recrudescenze”, cioè manifestazioni cliniche successive al primo attacco,
dovute a Plasmodi ancora presenti nel sangue. Non tutte le specie di Plasmodium seguono
però questa modalità lineare di sviluppo. Infatti, gli sporozoiti di P. vivax e P. ovale
possono restare quiescenti all’interno degli epatociti ("ipnozoiti") e riprendere lo sviluppo a
distanza di mesi, causando quelle che vengono definite "recidive".
1.3.2 Il plasmodio nell’uomo: fase eritrocitaria
I parassiti compaiono nel sangue periferico dopo 7-15 giorni dall’inoculazione degli
sporozoiti, a seconda della specie. I merozoiti formatisi nelle cellule epatiche penetrano nei
globuli rossi ma restano in contatto con il plasma sanguigno attraverso il dotto
parassitoforo, un canale delimitato da una membrana fospolipidica (Pouvelle et al., 1991).
Dentro l’emazia si trasformano in trofozoiti, dotati di un vacuolo digestivo, e iniziano a
sovvertire tutte le funzioni del globulo rosso: i parassiti si accrescono metabolizzando per
glicolisi il glucosio del sangue e utilizzando fattori di crescita e ADP presenti
nell’eritrocita. Il globulo rosso infettato aumenta di 50-100 volte il consumo di glucosio
con produzione di acido lattico mentre la fonte di azoto è rappresentata dalla parte proteica
dell’emoglobina. Gli eritrociti infetti scompaiono dal sangue periferico e vengono
sequestrati nei capillari degli organi interni (cervello, intestino, ecc.), così da sfuggire alla
distruzione nella milza, fenomeno chiamato “citoaderenza”. Il trofozoita si accresce
all’interno del globulo rosso fino alla fase successiva di schizonte che, a maturazione,
10

produrrà altri merozoiti, in numero variabile da 4 a 32 a seconda della specie di
Plasmodium.
A questo punto il globulo rosso si gonfia rapidamente fino a scoppiare liberando così nel
circolo sanguigno i merozoiti che, a questo punto, possono penetrare in altri globuli rossi
riprendendo la moltiplicazione schizogonica (Fig. 1.5).
Figura 1.5 Globulo rosso infetto da merozoiti
(http://www.smccd.edu/accounts/case/malaria/malaria_rbc.jpg)
Quando l’uomo inizia a produrre anticorpi anti-plasmodio, il parassita cessa di
moltiplicarsi e la morfologia cambia: iniziano a formarsi le forme sessuate che daranno
origine ai gametociti maschili (microgametociti) e femminili (macrogametociti); questi
resteranno nel globulo rosso in attesa che un anofele vettrice punga l’ospite infetto,
ingerendoli con il pasto di sangue.
1.3.3 Il plasmodio nell’Anofele: fase sporogonica
Nell’apparato digerente del dittero i gametociti abbandonano l’eritrocita e si
trasformano nelle forme sessuate mature (macro- e micro-gameti). La fecondazione del
macrogamete ad opera del microgamete, avviene nell’arco di circa un’ora dall’infezione e
origina uno zigote che, nell’arco di 24 ore, si trasforma in un oocinete mobile e
vermiforme. Al fine di sfuggire all’ambiente ostile dell’intestino, caratterizzato da
un’elevata concentrazione di enzimi digestivi, l’oocinete attraversa la membrana
peritrofica. Quest’ultima si forma nell’intestino della zanzara, subito dopo il pasto di
sangue, ed ha lo scopo di proteggere la zanzara da eventuali agenti patogeni ingeriti con il
sangue (Billingsley and Rudin, 1992). Subito dopo, il parassita inizia il processo
11

d’invasione dell’epitelio intestinale, mediato dal riconoscimento e successiva adesione
dell’oocinete alla superficie dei microvilli che rivestono l’epitelio intestinale. Raggiunto il
lato emocelico dell’intestino, al di sotto della membrana basale, l’oocinete si differenzia in
oocisti e nel giro di 7-15 giorni dall’infezione rilascia nell’emolinfa migliaia di sporozoiti
che raggiungono ed invadono le ghiandole salivari. Studi ultrastrutturali hanno dimostrato
che il processo d’invasione consiste di due fasi: un’iniziale adesione alla lamina basale
seguita dall’interazione con la membrana plasmatica e l’ingresso nelle cellule ghiandolari
(Pimenta et al., 1994) (Fig. 1.6). Specifiche proteine sporozoitiche, come CSP
(Circumsporozoite Protein) e MAEBL (Membrane Antigen/ Erythrocyte Binding Protein)
sembrano svolgere un ruolo in questo processo (Rodriguez and Hernandez-Hernandez Fde,
2004), mentre TRAP (thrombospondin related anonymous protein) sembra essere
coinvolta non solo nell’invasione delle cellule ghiandolari ma anche degli epatociti
(Robson et al., 1995; Matuschewski, 2006). Una volta raggiunte le ghiandole salivari gli
sporozoiti sono pronti per essere inoculati con la saliva nell’ospite vertebrato, dando inizio
a un nuovo ciclo infettivo.
Figura 1.6 Ciclo vitale di Plasmodium nella zanzara vettore
(Riehle et al., 2003).
12

1.4 Clinica
L’esito della malattia dipende da diversi fattori legati al parassita, all’ospite e alla
condizione sociale e geografica. Ciò può avere come effetto un quadro clinico che va
dall’infezione asintomatica fino alla malaria complicata che può portare alla morte del
paziente (Tab. 2).
Tabella 2 Schema riassuntivo dei fattori coinvolti nel esito
della malattia (Miller et al., 2002).
L’espressività clinica della malaria non complicata è caratterizzata dalla presenza di febbre
accompagnata da brividi e sudorazione eccessiva, dovuto alla rottura sincrona dei globuli
rossi con conseguente rilascio dei cataboliti del parassita nel plasma sanguigno. Gli episodi
febbrili possono essere inizialmente poco caratterizzati, ma nel corso dell’infezione
l’aumento della densità dei plasmodi nel sangue tende ad accentuare la sintomatologia. Le
manifestazioni cliniche della malaria complicata (anemia, ingrossamento della milza,
acidosi metabolica e malaria cerebrale) sono dovute all’invasione di tessuti e organi da
parte del plasmodio. Come precedentemente accennato, le manifestazioni cliniche possono
dipendere da fattori legati al parassita come, ad esempio, la resistenza ai farmaci, la
velocità del ciclo schizogonico negli eritrociti o la citoaderenza (Miller et al., 2002).
Plasmodium falciparum è responsabile della forma più virulenta di malaria umana con
circa 1 milione di morti l'anno, principalmente concentrati nell'Africa tropicale sub-
Sahariana. Ciò può dipendere, in una prima fase, dal fatto che il parassita può invadere
oltre il 50% dei globuli rossi provocando la morte del paziente per grave anemia in una
fase successiva, da un fenomeno assente nelle infezioni causate dalle altre 3 specie di
Plasmodium: la già citata citoaderenza dei globuli rossi infetti (Dolan et al., 1990). Questi,
13

infatti, esprimono sulla loro superficie molecole con proprietà adesive di produzione
parassitaria che fanno sì che gli eritrociti aderiscano gli uni con gli altri e con gli endoteli
dei vasi sanguigni, evitando così di essere trasportati alla milza dove verrebbero distrutti.
Se questo fenomeno, detto sequestramento, avviene a livello delle reti capillari degli organi
interni, ne consegue che i tessuti a valle dell'ostruzione non ricevono nutrimento ed
ossigeno. Il risultato finale sarà la necrosi degli organi interessati, con effetti disastrosi che
possono portare alla morte (es. malaria cerebrale). Invece, tra i vari fattori legati all’ospite,
particolare importanza riveste l’immunità. L’uomo mostra una certa resistenza al
plasmodio fino a circa sei mesi dalla nascita, dovuta sia alla difficoltà di questo a
metabolizzare l’emoglobina fetale, sia ad una parziale difesa fornita dall’immunità
materna. Di conseguenza, i soggetti più esposti al rischio di contrarre le forme gravi della
malattia sono i bambini in età compresa tra i 6 mesi e i 5 anni di età. A questi si
aggiungono le donne in gravidanza, coloro che hanno trascorso diversi anni fuori dall’area
endemica di origine, turisti provenienti da zone in cui la malattia non è presente e soggetti
immunodepressi. Infatti, anche dopo parecchie esposizioni al parassita, gli uomini non
sono totalmente protetti da successive infezioni, ma sviluppano soltanto una parziale
immunità che attenua ed a volte anche reprime completamente i sintomi della malattia.
Quindi l’immunità che il soggetto acquisisce è principalmente funzione dell’intensità
dell’infezione, ovvero dell’intensità della trasmissione. Anche i fattori sociali ed economici
giocano un ruolo importante nell’esito della malattia. Molti paesi in via di sviluppo sono
carenti nei servizi preventivi di base e l’inaccessibilità ai farmaci e cure adeguate può far
progredire rapidamente l’infezione fino a comportare la morte del soggetto.
1.5 Strategie e bersagli nella lotta antimalarica
Negli anni ’50 e ’60, la malaria è stata eradicata dalla maggior parte dei Paesi
temperati (Stati Uniti ed Europa), come conseguenza di un’evoluzione delle pratiche
agricole, della costruzione di case in muratura e soprattutto di programmi mirati al controlli
del vettore. Tuttavia nelle zone tropicali e sub-tropicali non si sono ottenuti gli stessi
successi. Queste differenze dipendono dagli stessi fattori che influenzano l'epidemiologia
della malaria, ossia dalle specie di plasmodio, dalle caratteristiche biologiche del vettore,
dall'ecosistema cui esso è legato ed infine l'uomo stesso (organizzazione sociale e grado di
immunità). Di fatto, il successo nell'eradicazione dell'infezione malarica fu ottenuto solo in
quelle zone geografiche che erano climaticamente marginali rispetto all'ecosistema che
mantiene stabilmente la malattia (ad esempio quello tropicale). L'endemia malarica nelle
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zone temperate era strettamente collegata all'endofilia del vettore, cioè alla tendenza a
pungere all'interno delle abitazioni e, soprattutto, a ricercare ambienti domestici durante la
fase di riposo post-prandiale. L’irroramento intradomiciliare di un insetticida ad azione
residuale come il DDT costituì un efficace fattore di destabilizzazione del sistema di
trasmissione, riducendo la densità dei vettori ed obbligando le zanzare a spostarsi
nell'ambiente esterno. Nelle zone temperate, caratterizzate da un rigido clima invernale, la
temperatura esterna risultò al di sotto della soglia necessaria al parassita per completare il
suo ciclo di sviluppo nel vettore, interrompendo quindi la trasmissione (Corbellini, 1998).
Come si è accennato, nei Paesi tropicali gli insetticidi ad azione residua non ebbero lo
stesso successo. Le temperature dell'ambiente esterno sono, di fatto, generalmente
favorevoli durante tutto l'anno alla sopravvivenza dei vettori ed allo sviluppo del
plasmodio all'interno della zanzara. Inoltre il livello di trasmissione della malattia, che in
alcune zone dell'Africa sub-sahariana può raggiungere e superare le 100 punture infettanti
per uomo l’anno, è tale che persino una riduzione del 90% della trasmissione non avrebbe
un impatto significativo sulla diffusione della malattia. Inoltre, in Italia i vettori malarici
appartenevano principalmente al complesso di specie Anopheles maculipennis, i cui focolai
larvali sono rappresentati prevalentemente da aree paludose permanenti, per cui la bonifica
di queste aree ha dato un contributo decisivo alla lotta contro il vettore. I vettori del
complesso An. gambiae, principali responsabili della trasmissione malarica nell'Africa sub-
sahariana, ed in particolare la specie nominale An. gambiae sensu stricto ed An. arabiensis,
sono, al contrario, strettamente legati all'uomo, ed utilizzano come ambiente larvale
raccolte d'acqua soleggiate create anche dall'attività umana (pozzanghere temporanee
alimentate dalle piogge e dai sistemi d'irrigazione, piccole impronte nel terreno, risaie
ecc.). Tali tipi di habitat risultano favoriti dalla diffusione dell'agricoltura e dell’irrigazione
nelle savane aride, dalla deforestazione e dalla desalinizzazione delle aree costiere. La
situazione nei Paesi tropicali è, inoltre, spesso aggravata dall'instabilità socio-economica e
dalla precarietà dei servizi sanitari (Greenwood and Mutabingwa, 2002; Sachs and
Malaney, 2002).
Attualmente le strategie di controllo della malaria si basano principalmente su:
diagnosi e trattamento della malaria
controllo del vettore
Nel primo caso l’obiettivo principale è quello di ridurre la mortalità e la morbilità legati
alla malaria nonché limitare la sua trasmissione attraverso la riduzione del serbatoio di
infezione. Per ottenere ciò, si sta cercando di realizzare o migliorare l’accesso a strutture
15

sanitarie in cui si possa effettuare una diagnosi rapida di malaria, permettendo di effettuare
una terapia precoce dei casi clinici. Un’ulteriore strategia è quella di migliorare la
disponibilità di farmaci antimalarici ed eseguire una profilassi nei soggetti a rischio
(bambini di età inferiore a cinque anni e donne in stato di gravidanza) (Malaria Report,
2008).
La necessità di disporre nei prossimi anni di nuovi strumenti di controllo della malattia
assume oggi particolare rilievo, in considerazione della progressiva diffusione di ceppi
parassitari farmaco-resistenti. I farmaci a basso costo, come clorochina e sulfadoxina-
pirimetamina, hanno infatti perso gran parte della loro efficacia sia nelle aree di origine
della farmaco-resistenza (Sud-Est Asiatico), sia in Africa sub-sahariana, dove il livello
economico delle popolazioni non è in grado di sostenere il costo dei farmaci di ultima
generazione, in particolare di quelli basati su associazioni di
più molecole tra le quali l’artemisina.
Il controllo dei vettori costituisce una strategia fondamentale nella lotta alla malaria e
in passato è stata determinante nell’eradicazione della malattia nelle zone temperate.
L'interruzione del contatto tra vettore e uomo può avvenire con sistemi di protezione
passiva e/o attiva. I sistemi di protezione passiva sono vere e proprie barriere meccaniche il
cui scopo è quello di prevenire la possibilità di contatto con il vettore. Ad esempio, le
zanzariere poste alle aperture delle abitazioni (ad es. porte e finestre) o intorno ai letti,
costituiscono un sistema di protezione passiva efficace nell’impedire meccanicamente il
passaggio dell’insetto (Fig. 1.7). Inoltre, il trattamento di queste con insetticidi piretroidi ne
aumenta l’efficienza in quanto combina l’effetto meccanico a quello repellente o letale
dell’insetticida. L’utilizzo delle zanzariere impregnate con insetticidi come strumento di
controllo della malaria sia collettivo che individuale è stato introdotto negli anni quaranta
e, come dimostrato da diversi studi fra cui quello di Alonso et al., (1991), l’uso di
zanzariere e tende trattate con insetticida ha determinato una riduzione del 50% della
morbidità infantile e del 20-30% della mortalità globale in Gambia, Ghana e Kenya.
16

Figura 1.7 Una delle misure di lotta antimalarica è
rappresentata da tende e zanzariere impregnate con
insetticidi, da appendere alle aperture delle abitazioni e sui
letti.
La lotta attiva contro i vettori adulti prevede l’utilizzo di insetticidi ad azione residua
che possono essere applicati all’interno delle abitazioni, all’esterno o, come
precedentemente accennato, su tende e zanzariere da letto (Fig. 1.8). Il successo di queste
strategie richiede il continuo monitoraggio dell’evoluzione e della diffusione di
meccanismi di resistenza nelle popolazioni vettrici bersaglio. Infatti, a partire dal primo
caso di resistenza al DDT osservato nel 1947, la prevalenza e l’incidenza della resistenza
sono aumentate, di anno in anno, con un tasso allarmante.
Figura 1.8 La diffusione di insetticidi ad azione residua
all'interno delle abitazione rappresenta un esempio di lotta
attiva contro la forma adulta del vettore.
17

Un altro sistema di protezione attiva è quello rivolto alle larve (Fig. 1.9). Si realizza
mediante il trattamento dei focolai con larvicidi chimici (ad es. il Temephos) o con ormoni
regolatori della crescita (Diflubenzuron o Pyriproxyfen), che uccidono le larve o ne
bloccano lo sviluppo alla fase adulta. Un altro metodo, volto all’abbattimento della
popolazione larvale, è rappresentato dall’introduzione di pesci larvivori (ad es. Poeciliidae
quali Gambusia affinis), oppure di altri organismi (ad es. Bacillus thuringensis o B.
sphaericus) in grado di produrre spore tossiche per le larve. Queste spore sono molto
efficaci, ma il loro impiego nella lotta antilarvale è limitato dal loro costo e dal fatto che,
una volta liberate sul pelo dell’acqua, in breve tempo tendono a concentrarsi sul fondale. Il
rimedio antilarvale senza dubbio più efficace è costituito dal risanamento ambientale. La
corretta gestione delle acque stagnanti superficiali, infatti, ha una importanza cruciale nel
controllo della densità della popolazione del vettore. Ad esempio, la produzione di mattoni
di argilla a scopo edilizio comporta la formazione di fosse che facilmente possono
riempirsi di acqua piovana e divenire focolai di sviluppo larvale. La creazione di canali di
scolo in cemento costituisce un valido rimedio per impedire il ristagno di acqua.
Figura 1.9 Controllo attivo sullo stadio larvale del vettore
Nell’ambito delle strategie di controllo in fase di sperimentazione va infine
menzionato il tentativo di mettere a punto zanzare transgeniche refrattarie alla trasmissione
del parassita. Progressi notevoli in questa direzione sono stati ottenuti nella comprensione
dei meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria innata del vettore verso il
parassita e delle interazioni molecolari tra ospite invertebrato e parassita, che si verificano
nel corso del ciclo sporogonico (per esempio durante la penetrazione dell’oocinete nella
parete intestinale del vettore e/o nel processo di invasione delle ghiandole salivari). A
questi indubbi progressi sperimentali non corrisponde però, allo stato attuale, un progresso
18

parallelo delle conoscenze sulla fattibilità di sostituire popolazioni selvatiche del vettore
con l’eventuale zanzara transgenica refrattaria e sulla possibilità di risolvere gli ostacoli
etici che tale operazione, inevitabilmente, comporterebbe (Kilama and Ntuomi, 2009).
19

1.6 Epidemiologia
Per un’adeguata valutazione del livello di trasmissione malarica di una determinata area
geografica è necessario conoscere non solo la diffusione della malattia nella/e
popolazione/i che la abitano, ma anche il livello di trasmissione del parassita e la densità
vettoriale. Vanno quindi prese in esame le diverse specie di Anopheles presenti nella
regione, la loro abbondanza relativa, le loro abitudini alimentari, oltre a una serie di fattori
ambientali che possono influenzare lo sviluppo e il comportamento del vettore, quali la
temperatura, l’umidità, le piogge e la conformazione del territorio. Per quanto riguarda
l’ospite è inoltre necessario avere informazioni sulle condizioni igienico-sanitarie generali
della popolazione, oltre ad un esame specifico del sangue e della milza dei singoli soggetti.
1.6.1 Vettore idoneo
Il Genere Anopheles comprende 484 specie tra cui sono presenti le circa 60 specie vettrici
accertate di malaria umana, ma di queste solo una trentina sono considerate efficienti
vettori (Fig. 1.10; Hamon and Mouchet, 1961; Carnevale and Robert 2009).
Figura 1.10 Distribuzione mondiale delle specie di Anopheles
(Kiszewski et al., 2004)
20

Vi sono infatti alcune fondamentali caratteristiche fisiologiche e comportamentali che
rendono una zanzara anofelina un vettore idoneo alla trasmissione di un patogeno umano
come il plasmodio della malaria:
- deve essere antropofila, ovvero essere attratta preferenzialmente da stimoli olfattivi
prodotti dall'uomo e compiere il pasto di sangue preferenzialmente su di esso;
- deve essere endofaga, ovvero essere propensa ad entrare nelle abitazioni per
pungere;
- deve essere presente nel territorio con densità significative;
- deve essere sufficientemente longeva per permettere il completamento del ciclo
sporogonico. Infatti, se il ciclo sporogonico di Plasmodium falciparum impiega 10
giorni a 30°C e la specie di anofele coinvolta nella trasmissione ha una longevità
media da adulto di soli 9 giorni, è evidente che questa specie non potrà essere un
vettore efficace, in quanto la maggior parte dei suoi individui morirà prima che la
sporogonia sia completata;
- deve avere abitudini tali da vivere a temperature relativamente elevate, perché il
ciclo sporogonico di Plasmodium è temperatura-dipendente: se l'Anofele vive a
temperature relativamente basse (per esempio inferiori a 22-23°C), la durata del
ciclo sporogonico si allungherà molto, superando a volte 20 giorni, eccedendo
quindi la longevità media del vettore. Uno dei fattori che hanno consentito
l'eradicazione della malaria in Italia è stato proprio il fatto che il nostro Paese
appartiene alla fascia climatica temperata, con inverni lunghi e freddi e con estati le
cui notti, nelle zone rurali, possono avere temperature al di sotto dei 20°C. Di
conseguenza, le zanzare sono soggette a temperature medie piuttosto basse, cui
corrisponde un allungamento del ciclo sporogonico e una conseguente minore
probabilità di avere sporozoiti infettanti nelle ghiandole salivari.
Quindi, è la presenza contemporanea di queste caratteristiche che rende una zanzara un
vettore efficace di malaria. Esempi emblematici sono le specie afrotropicali appartenenti al
complesso Anopheles gambiae e al gruppo Funestus, responsabili di oltre il 90% della
trasmissione malarica in Africa continentale, che da sola rappresenta più dell’85% dei casi
di malaria e più del 90% dei portatori di plasmodi nel mondo.
21

1.6.2 Indici entomologici di trasmissione
La comprensione delle dinamiche di trasmissione della malaria all’interno di una
popolazione è fondamentale per diversi motivi. Innanzitutto ci permette di delineare le
zone a rischio e ottenere stime affidabili della malattia. Inoltre, è estremamente utile per la
pianificazione e l’implementazione delle strategie di prevenzione e controllo. L’entità della
trasmissione malarica in una data area si può stimare quantitativamente attraverso il
calcolo di quattro indici principali: il Tasso di Inoculazione Entomologica (Entomological
Inoculation Rate o EIR), il Tasso di Riproduzione di Macdonald, la Capacità Vettrice di
Garrett-Jones e l’Indice di Stabilità.
1.6.2.1 Tasso di Inoculazione Entomologica
Il tasso di inoculazione entomologica, definito dal parametro h, è largamente utilizzato per
la valutazione della trasmissione della malaria (Corran et al., 2007). Questo indice, che
definisce il numero di punture infettanti per persona per unità di tempo (solitamente un
anno), si ottiene moltiplicando per l’indice sporozoitico il numero di punture per persona
per notte:
h = MaS
dove (Ma) è il numero di punture che il vettore compie nell’arco di tempo sull’uomo (M è
il numero di Anopheles per persona ed a è il numero medio di persone punte da un
Anopheles in un giorno), S è l’indice sporozoitico (la percentuale di zanzare infettanti sul
totale).
L’EIR è tutt’ora il metodo più diretto per la valutazione delle misure di controllo vettoriale,
dato che quantifica la proporzione di zanzare infettanti e la loro propensione a trasmettere
parassiti alla popolazione umana (Shaukat et al., 2010). I metodi entomologici usati per
stimare l’indice h si basano su diverse modalità di cattura di zanzare adulte tra cui le
catture con insetticidi piretroidi e l’utilizzo di trappole ad attrazione luminosa, tipo CDC.
Altri metodi di cattura, come lo human landing catch, hanno lo svantaggio di impiegare
adulti volontari come “esche”, sollevando numerosi problemi di ordine etico e
introducendo bias di campionamento dovuti alla diversa attrattività dei soggetti utilizzati
come esche e la diversa abilità nel catturare le zanzare in fase di puntura. In generale,
questi diversi metodi di campionamento presentano efficienze di cattura molto diverse,
oltre a presentare dei bias dovuti alle diverse proporzioni degli stadi fisiologici delle
zanzare catturate (alcuni metodi sono più efficaci nel catturare alcuni stadi rispetto ad
22

altri). Inoltre, la stima dell’EIR è soggetta all’influenza delle fluttuazioni stagionali e delle
eterogeneità nei diversi microhabitat sulla dinamica di popolazione dei vettori. Infatti, le
densità vettoriali possono variare di ordini di grandezza tra case adiacenti, condizionando
fortemente le stime basate sul campionamento di zanzare a riposo all’interno delle
abitazioni (Billingsley et al., 2006; Drakeley et al., 2003; Beier et al., 1999). A questo si
aggiunge anche il confondente dovuto alla particolare dinamica di sviluppo delle
popolazioni di Anopheles durante la stagione delle piogge, in cui si osserva uno sviluppo
sincronizzato degli individui (coorti), che si traduce in una alternanza di fasi a densità
elevate di zanzare giovani non infettanti e fasi con popolazioni più vecchie, con indici
sporozoitici più elevati (Peterson et al., 2009). Quindi, la stima dell’EIR è soggetta ad
errori di sovrastima o sottostima, soprattutto in zone in cui la densità di zanzare infette è
molto bassa.
1.6.2.2 Tasso di Riproduzione di Macdonald
Il Tasso di Riproduzione z di Macdonald (1957) è definito dalla seguente formula:
dove:
- m è il numero medio di vettori per uomo;
z = ma 2 bp n /r (-lnp)
- a è il numero medio di punture su uomo per giorno per vettore; il valore di a è legato
all’antropofilia del vettore. Si ricava dal rapporto della frequenza delle punture su uomo
(HBI = Human Blood Index, un indice che definisce la proporzione di pasti di sangue su
uomo; si ricava dall'identificazione della specie a cui appartiene il sangue ingerito dalla
zanzara) diviso per frequenza in giorni di puntura del vettore, che può compiere un pasto di
sangue ogni 2 o più giorni;
- ma è quindi il numero medio di punture per uomo per giorno; questo parametro si ottiene
per mezzo di osservazioni dirette sul campo, mediante la conta del numero di punture
ricevute in un giorno da soggetti volontari (ad esempio tramite human landing catch);
- b è la proporzione di anofeli portatori di sporozoiti (anofeli infette e infettanti);
- r è la proporzione giornaliera della popolazione umana infettata che passa allo stato non
infetto (tasso di guarigione parassitaria);
23

- p è la probabilità di sopravvivenza quotidiana del vettore;
- n è la durata in giorni del ciclo sporogonico o, in altre parole, il numero di giorni che
intercorrono tra il momento in cui il vettore si infetta e quello in cui diviene infettante;
- p n è la probabilità che il vettore infettato divenga infettante; ossia che sopravviva fino al
termine del ciclo sporogonio;
- p n /-ln(p) è l'attesa di vita dei vettori infettanti dopo n giorni;
sulla base delle definizioni sopra descritte, la formula del tasso di riproduzione z è
spiegabile nel seguente modo: un soggetto infetto, non immune al plasmodio, è infettante
per 1/r giorni. Durante ciascuno di questi giorni, è punto da ma anofeli, ciascuna con una
aspettativa di vita infettante di p n /(-lnp). Durante questo periodo ciascuna anofele pungerà
a persone/giorno, con una proporzione b di punture infettanti. In queste condizioni, z
rappresenta il numero totale di potenziali infezioni secondarie à partire da un caso
primario. Se il tasso di riproduzione è inferiore a 1 la parassitosi avrà tendenza a sparire, se
invece è superiore a 1 la propagazione del plasmodio persiste nella popolazione umana e,
secondo questa formula, le caratteristiche epidemiologiche della trasmissione
dipenderanno essenzialmente dalla longevità e dall’aggressività delle anofeli vettrici.
In condizioni reali il tasso di riproduzione risente di fattori quali l’immunità degli ospiti e
l’esistenza di infezioni precedenti nei soggetti umani (sovra-infezioni e immunità
concomitante), nonché infezioni precedenti nelle anofeli, che limitano la possibilità di
acquisire nuove infezioni. Di conseguenza, in condizioni di malaria stabile si calcola un
tasso “netto” di riproduzione z0:
z0 = p n / p n -s
composto esclusivamente dai parametri entomologici longevità (p), infettività (s) e
sviluppo sporogonico (n). Il tasso z0 ha avuto un ruolo centrale nell’epidemiologia della
malaria (e di altre malattie infettive) poiché fornisce un indice di intensità della
trasmissione definendo anche delle soglie teoriche.
24

1.6.2.3 Capacità vettrice
La capacità vettrice (C) è definita come il numero di punture potenzialmente infettanti che
possono originare, in un giorno, da un soggetto portatore di gametociti in grado di infettare
tutti i potenziali vettori che compiono su di esso un pasto di sangue. La relazione che
intercorre tra i parametri che influenzano la capacità vettrice è stata descritta da Garrett-
Jones (1964) attraverso la seguente formula:
C ma
2
p
n
ln
Quindi, un portatore di gametociti è punto in media da ma vettori per giorno; una frazione
p n di questi vettori sopravvive per un periodo di n giorni equivalente alla durata del ciclo
sporogonico; i sopravvissuti vivono in media per altri 1/-loge(p) giorni, durante i quali
prenderanno a pasti di sangue su uomo per giorno. Il valore C che ne risulta è una stima
del numero medio di punture infettanti che derivano giornalmente da un caso infettante di
malaria ed è molto simile allo z di Macdonald, dato che differisce solo per l’assenza dei
parametri b ed r. Infatti, la capacità vettrice non tiene conto dell’infettività dell’ospite
umano per l’anofele (1/r) e dell’infettività dell’anofele per l’uomo (b), da cui: C = z r/b. La
capacità vettrice deve essere calcolata per ogni specie anofelica considerata e, nel caso di
situazioni epidemiologiche comprendenti più specie vettrici, la capacità vettrice
p complessiva sarà la somma dei valori di C di ciascuna specie.
1.6.2.4 Indice di stabilità
L’indice di stabilità, anche questo calcolato da Macdonald (1957) è definito dalla formula
a/-lnp. È un indice interamente entomologico che tiene conto di 3 parametri: l’antropofilia,
la durata del ciclo gonotrofico (il cui rapporto permette di calcolare a) e la longevità p. Da
questo indicatore si ottiene quindi il numero di contatti ospite-vettore nel corso della vita di
quest’ultimo. Più grande sarà questo valore, più alto sarà l’indice di stabilità. Secondo
Macdonald, se l’indice è inferiore a 0,5 siamo in condizioni di malaria instabile, se è
superiore a 2,5 siamo in una condizione di malaria stabile. Tra queste due soglie si
definiscono varie condizioni intermedie (Macdonald, 1957; Mouchet et al., 2004).
Un’analisi comparativa dei fattori sopra elencati ha permesso di individuare
all’interno del genere Anopheles le specie più efficienti quali vettori di plasmodi umani e,
in particolare, di riconoscere in alcune specie appartenenti al complesso An. gambiae i
principali vettori di malaria al mondo (Coluzzi, 1984; 1992). Tali specie sono responsabili
25

dell’elevatissimo livello di trasmissione della malaria che si osserva nell’Africa sub-
sahariana (con valori di capacità vettrice spesso superiori a 10, con punte di 30), molto
superiore a quello osservato in altre zone tropicali con paragonabili situazioni socio-
economiche e sanitarie.
1.6.3 Indici parassitologici di trasmissione
Gli indici entomologici sopra descritti non rappresentano l’unica misura possibile della
trasmissione malarica. Esistono infatti metodi indiretti di largo utilizzo, come gli indici
parassitologici. Tra questi, quelli maggiormente utilizzati sono: l’indice parassitario (PR),
l’indice parassitario annuale (API) e l’indice splenico (SR) (Shaukat et al., 2010).
L’indice parassitario misura la percentuale della popolazione che presenta parassiti
asessuati nei globuli rossi. Tale misurazione può anche essere effettuata sui gametociti
(indice gametocitico), in cui si considera la percentuale di individui di una popolazione il
cui sangue periferico contiene forme pre-sessuate del parassita. Con questo parametro,
inoltre, si stabilisce il potenziale infettante della popolazione stessa. Non tutte le persone
infette hanno però un numero di gametociti sufficiente per infettare le zanzare: è necessario
almeno un gametocita maturo di P. falciparum ogni 200 leucociti perché si abbia la
trasmissione (De Carneri, 1997). Entrambi gli indici possono essere calcolati stratificando
la popolazione per gruppi di età. Questa misurazione ha il vantaggio di dare un’ immagine
diretta dell’inoculazione e dell’immunità dell’ospite nonché dell’efficacia di eventuali
trattamenti.
L’indice parassitario annuale, invece, misura il numero di casi di malaria su 1000
persone per anno che si verificano in un’area geografica ben definita. Il vantaggio pratico
di quest’indice è quello di fornire un riscontro pratico sugli effetti delle misure di
prevenzione e di controllo malarico attuate in un’area geografica.
Entrambi gli indici presentano diversi svantaggi dovuti alla bassa sensibilità della metodica
in situazioni di grande variazioni dei livelli parassitari nel tempo. Ciò è dovuto alla breve
persistenza (circa 2 settimane) della parassitemia nel sangue periferico in seguito ad ogni
infezione (Pringle and Avery-Jones, 1966). Inoltre, la stima degli indici può essere
influenzata anche da altri fattori. L’uso di farmaci antimalarici, così come la presenza di
ceppi resistenti, possono comportare effetti non prevedibili sulla prevalenza del parassita
in popolazioni non-immuni residenti in zone a bassa trasmissione. Ancora, la quantità dei
parassiti circolanti può essere sottostimata in zone ad alta trasmissione per via
26

dell’immunità acquisita dell’individuo. Infatti, in condizioni di alti livelli di immunità
acquisita si verifica una rapida clearance dei parassiti dalla circolazione sanguigna,
comportando una sottostima della trasmissione. Inoltre, l'individuazione dei parassiti
mediante microscopia necessita di personale altamente qualificato, di precisione e
sensibilità, soprattutto in zone di bassa trasmissione.
Infine, un’altra misura indiretta del rischio di malaria è l’indice splenico, che fu
introdotto per la prima volta in India da Dempster nel 1848, prima ancora che si scoprisse
l’agente eziologico della malaria. Quest’indice si basa sul principio per cui un’esposizione
cronica alla malaria comporta l’ingrossamento della milza. Di conseguenza, la misurazione
della percentuale di individui che presentano ingrossamento della milza è direttamente
correlata con il rischio di infezione all’interno di una comunità. Generalmente, l’indice
viene calcolato sui bambini di 2-9 anni in quanto l’ingrossamento della milza è maggiore
nel momento in cui si sviluppa il sistema immunitario. Mediante questo indice, una
determinata area geografica può essere definita:
Ipoendemica: se l’indice splenico è compreso tra 0 e 10%. Sono aree in cui
la trasmissione è bassa.
Mesoendemica: se l’indice splenico è compreso tra 11 e 50%. Si tratta
tipicamente di zone rurali in regioni subtropicali con un’intensità di
trasmissione variabile.
Iperendemica: quando l’indice splenico supera il 50% nei bambini ed è
elevato anche negli adulti. Sono zone con trasmissione intensa ma
stagionale, che non consente alle popolazioni che vi abitano di sviluppare
un’immunità sufficiente a prevenire i sintomi della malaria.
Oloendemiche: quando l’indice splenico supera il 75% nei bambini ed è
invece bassso negli adulti. Si tratta di zone ad alta trasmissione costante; le
popolazioni che le abitano sviluppano di solito un considerevole livello di
immunità in tutte le fascie d’età, in particolare negli adulti (Bruce-Chwatt,
1985).
Tuttavia, questo indice è soggetto a una sovrastima dei casi di splenomegalia dovuti alla
malaria, quindi potrebbe non fornire una precisa misura delle differenti esposizioni
all’infezione. Infatti, l’ingrossamento della milza è stato visto anche per altre parassitosi
quali leishmaniosi viscerale e nell'infestazione da Schistosoma mansoni. Inoltre, in
condizioni di epidemia di malaria, in cui il rischio di infezione può essere molto alto,
27

l’indice può risultare vicino allo zero in quanto l’esposizione è acuta ma non cronica.
Quindi, l’indice splenico risulta utile, come misura relativa del rischio, solo in situazioni di
malaria stabile (Denise L. Doolan, 2002).
1.6.4 Indicatori sierologi di trasmissione
Considerando i limiti dati dai metodi entomologici e parassitologici, recentemente si è
assistito allo sviluppo di altri metodi per la valutazione del rischio di esposizione: sono
state create numerose mappe per ottenere modelli climatici arricchiti di informazioni
riguardanti le precipitazioni, la temperatura e l’umidità relativa. Questi sono sicuramente
fattori importanti per la sopravvivenza e la riproduzione dell’insetto vettore e lo sviluppo
del parassita nel vettore stesso. Tuttavia, sebbene mostrino un buon accordo con i dati
empirici a livello regionale e di nazione (Craig et al., 1999), questi modelli non si prestano
per predizioni di endemicità malarica a livello della comunità individuale (Omumbo et al.,
2004). Risulta, quindi, fondamentale avere misurazioni dirette della trasmissione di malaria
all’interno della comunità. Inoltre, è necessario che questi metodi siano caratterizzati da
un’elevata sensibilità, in modo da poterne usufruire anche in zone in cui la trasmissione è
bassa.
In seguito allo sviluppo di affidabili tecniche sierologiche, la misurazione della prevalenza
di anticorpi anti-malaria nella popolazione locale rappresenta un potenziale indicatore del
livello di trasmissione della malaria (Burattini et al., 1993). Draper, Voller e Carpenter,
furono tra i primi ad applicare i dati sierologici ad un modello matematico al fine di
stimare il tasso di infezione. Inoltre, misero in evidenza una proprietà importante dei dati
sierologici: i dati raccolti in un indagine sierologica rappresentano la prevalenza di un
“periodo” (l’esperienza totale di malaria in una comunità) in netto contrasto con la
prevalenza del “momento” ottenuta dai dati parassitologici (Draper et al., 1972). Infatti, gli
anticorpi possono persistere per mesi o anni dopo l’infezione rendendo questo metodo
relativamente robusto a variazioni nella trasmissione che avvengono a breve termine
(Corran et al., 2007) ma inappropriato per stimare l’esposizione alla malaria al livello
individuale. Sebbene sia ancora dibattuta la persistenza degli anticorpi anti-malaria (Struik
and Riley, 2004) è stato osservato che persistono decisamente più a lungo rispetto alle
infezioni individuali e alle zanzare infette. Inoltre, è stato dimostrato che i livelli
anticorpali aumentano rapidamente in individui che sono nuovamente esposti durante un
epidemia (Migot et al., 1995), come anche in popolazioni da cui la malaria è stata
eliminata di recente (Kaneko et al., 2000). Tuttavia, l’esistenza di una memoria della
28

isposta anticorpale della durata di diversi anni (Bouchaud et al., 2005) è stata osservata
negli adulti, mentre nei bambini al di sotto dei 5 anni la durata della risposta anticorpale è
di circa 3-4 mesi (Akpogheneta et al., 2008) e si osserva una variazione in accordo alla
stagione di trasmissione (Taylor et al., 1996). Nel corso degli anni, gli studi sierologici
sono stati usati per valutare l’intensità di trasmissione (Voller and Bruce-Chwatt, 1968), la
sua riduzione in seguito all’applicazione di misure di controllo (Cornille-Brogger et al.,
1978) e l’eradicazione (Bruce-Chwatt et al., 1973). Le analisi sierologiche sono state
utilizzate anche per valutare il rischio relativo di infezione in viaggiatori europei di ritorno
da aree malariche (Nothdurft et al., 1999). Quindi, la prevalenza degli anticorpi verso
antigeni malarici ha fornito in varie occasioni un’indicazione indiretta del rischio di
infezione correlandola con i tassi splenici, la prevalenza di strisci di sangue positivi e la
densità parassitaria (Genton et al., 1995; Al-Yaman et al., 1995; May et al., 1999).
Tuttavia, è stato visto che l’uso di un singolo antigene per le indagini siero-
epidemiologiche può comportare una riduzione della sensibilità del saggio. Inoltre, la
risposta anticorpale può risentire dei polimorfismi antigenici che determinano una diversità
di risposta (Good et al., 1993; Taylor et al., 1996). Sembrerebbe quindi vantaggioso
utilizzare una combinazione di antigeni di differenti specie (Drakeley and Cook, 2009)
oppure antigeni altamente immunogenici quali AMA-1 (Apical Membrane Antigen 1) in
zone di bassa trasmissione o in aree in cui è necessario confermare l’eradicazione, mentre
si potrebbe sfruttare la bassa immunogenicità di antigeni come MSP-119 (Merozoite
Surface Protein 119) in zone ad alta trasmissione (Corran et al., 2007). Tuttavia, nessun
test sierologico attualmente disponibile rappresenta un’alternativa affidabile ai metodi
entomologici per una misura quantitativa della trasmissione malarica (Doolan, 2002).
29

1.7 Interazione zanzara-ospite
1.7.1 Le ghiandole salivari e la saliva
Nel processo di trasmissione del plasmodio della malaria, le ghiandole salivari di
zanzare vettrici rappresentano un organo di estrema importanza. Ogni zanzara ha una
coppia di ghiandole localizzate nella porzione ventrale del torace. Le ghiandole salivari di
Anopheles presentano un dimorfismo sessuale in relazione al fatto che le femmine, oltre a
nutrirsi di liquidi zuccherini di origine vegetale, fanno anche un pasto di sangue.
Quest’ultimo è essenziale per la riproduzione in quanto viene utilizzato per sintetizzare il
tuorlo delle uova (James and Rossignol, 1991). Le ghiandole femminili sono circa cinque
volte più grandi di quelle maschili e differiscono, oltre che morfologicamente, anche per le
proprietà biochimiche delle molecole di superficie nonché per le secrezioni salivari (James,
1994, Lombardo et al., 2006). Ciascuna ghiandola è costituita da tre lobi, due laterali ed
uno mediano (Fig. 1.11) con quelli laterali distinguibili in una porzione prossimale ed una
distale. Studi di espressione genica condotti su Aedes aegypti e Anopheles gambiae hanno
dimostrato che i geni coinvolti nell’assunzione del pasto di sangue sono espressi
principalmente nella porzione distale-laterale; invece la porzione prossimale-laterale
esprime geni coinvolti nella digestione di zuccheri o in altre funzioni ghiandolari più
generali (James, 1994; Arcà et al., 1999). Queste evidenze morfologiche e biochimiche si
correlano in modo positivo con l’osservazione che gli sporozoiti invadono
preferenzialmente i lobi nella porzione distale-laterale. Il lobo mediano è connesso ai due
lobi laterali mediante una corta regione, simile a un collo di bottiglia, ed è stato ipotizzato
un suo ruolo nel trasporto dei fluidi. Ognuno dei tre lobi è composto da un singolo strato di
cellule epiteliali che rivestono un dotto centrale; i tre dotti di ogni ghiandola si fondono
assieme convergendo in un unico canale salivare che si apre al livello dell’ipofaringe.
30

Figura 1.11 Immagini al microscopio ottico di
ghiandole salivari di An. gambiae. Sono evidenziate le
regioni corrispondenti al dotto salivare (sd), al lobo
mediale (m) ed alla porzione prossimale (pl) e distale (dl)
dei lobi laterali (Lombardo et al., 2006).
Durante il pasto di sangue, la zanzara inietta nell’ospite la saliva che ha la funzione
di facilitare l’assunzione del pasto di sangue grazie alla presenza di fattori anti-emostatici,
anti-infiammatori ed immunomodulatori. Lo studio della saliva di artropodi ematofagi ha
permesso di individuare fattori in grado di contrastare tutte e tre le componenti della
risposta emostatica dei vertebrati: coagulazione, aggregazione piastrinica e
vasocostrizione. Sebbene siano state studiate solo un numero limitato delle oltre 15.000
specie di artopodi ematofagi risulta evidente una profonda diversità delle sostanze secrete.
Ciò conferma l’idea che l’adattamento all’ematofagia abbia avuto origine
indipendentemente più volte nell’evoluzione, rappresentando quindi un buon esempio di
evoluzione convergente (Ribeiro, 1995; Ribeiro and Arcà, 2009).
Meccanismi estremamente diversi vengono usati da differenti artropodi ematofagi
per ottenere vasodilatazione. Per esempio gli emitteri Cimex lectularius e Rhodnius
prolixus usano le nitroforine: si tratta di proteine in grado di trasportare e di rilasciare
ossido nitrico (NO) nel sito d’inoculazione e di legare successivamente istamina, un
importante modulatore della risposta infiammatoria (Valenzuela and Ribeiro, 1998;
Champagne et al., 1995). Aedes aegypti, invece, utilizza le sialochinine I e II, dei
decapeptidi capaci di stimolare il rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali. Le
anofeline, infine, impiegano un enzima ad attività perossidasica in grado di distruggere
ammine biogeniche quali la serotonina e la norepirefrina, inibendo così la vasocostrizione
(Ribeiro and Nussenzveig, 1993).
31

Una simile ampia varietà è stata riscontrata per gli anticoagulanti. Si è visto che le
sostanze principalmente sintetizzate dagli emitteri (R. prolixus e Eutriatoma maculatus)
sono dirette contro il fattore VIII e la trombina mentre il dittero simulide Simulum vittatum
sintetizza inibitori del fattore Xa, del fattore VII e un antitrombinico. Poiché i tempi
d’innesco per la coagulazione sono superiori alla durata media di un pasto di sangue si
suppone che queste sostanze giochino un ruolo importante nel prevenire la formazione di
coaguli che potrebbero ostruire l’apparato boccale. Inoltre, in Anopheles è stato osservato
che tali molecole potrebbero facilitare i processi digestivi che seguono la pre-diuresi
durante la quale vengono concentrate cellule e proteine sieriche e viene secreta l’acqua in
eccesso nel sangue (James, 1994, Ribeiro, 1995).
Gli antipiastrinici mostrano invece una minore eterogeneità nel bersaglio. La
maggior parte degli artropodi ematofagi impiega molecole con attività apirasica.
Quest’enzima è responsabile della conversione dell’ATP e ADP in AMP e pirofosfato, in
modo da inibire il processo d’aggregazione e reclutamento delle piastrine ADP-dipendente.
L’analisi molecolare ha rilevato l’esistenza di 3 classi di apirasi con origini evolutive
differenti. In Aedes e Anopheles l’attività apirasica è svolta da un membro della famiglia
delle 5’-nucleotidasi (Champagne et al., 1995; Lombardo et al., 2000). Negli emitteri (C.
lectularius e R. prolixus) e nel flebotomo Phlebotomus papatasi tale attività e svolta da una
differente famiglia di proteine strettamente dipendenti dal calcio (Valenzuela et al., 2001).
La terza classe di apirasi appartiene alla famiglia delle ecto-ATPasi ed è stata isolata
originariamente in Toxoplasma gondii (NTPasi I e II), oltre ad essere stata ritrovata in una
grande varietà di organismi, tra cui piante e uomo (Asai et al., 1995).
1.7.2 Risvolti applicativi dello studio sulle ghiandole salivari
Negli ultimi anni lo studio delle ghiandole salivari di vettori di malattie quali
malaria, dengue o leishmaniosi ha suscitato notevole interesse negli entomologi
molecolari. Ciò è in parte da attribuirsi alla necessità di una più adeguata comprensione del
loro ruolo nella trasmissione del patogeno e delle proprietà biochimico-farmacologiche
della saliva. Esistono però anche importanti risvolti applicativi legati a questi studi, come
ad esempio la possibilità di sviluppare componenti di vaccini (Titus et al., 2006).
Numerose indicazioni suggeriscono che la saliva degli insetti vettori svolge un
ruolo importante nella trasmissione dei parassiti ed il modello esemplare, in questo senso, è
rappresentato da un modello murino di leishmaniosi. Infatti, la saliva di Lutzyomyia
32

longipalpis aumenta considerevolmente la frequenza e la gravità dell’infezione del
parassita in topi non esposti in precedenza a punture di flebotomo (Titus and Ribeiro.,
1988). Tuttavia, topi immunizzati con la saliva dell’insetto acquisiscono un certo grado di
protezione dalla leishmaniosi cutanea. La caratterizzazione delle proteine coinvolte ha
permesso di sviluppare due possibili nuovi vaccini che conferiscono protezione contro
l’infezione da L. major e sono basati su due proteine salivari: il maxadilan (Max) e SP15.
Max è una molecola che interferisce con la normale attività macrofagica in quanto inibisce
la produzione di NO e TNF-γ essenziali per una risposta protettiva nei confronti del
parassita (Titus et al., 2006). Invece, la funzione svolta dalla saliva di Anopheles nella
trasmissione del plasmodio è molto meno chiara. Il raggiungimento della piena infettività
degli sporozoiti non sembra essere, come supposto in precedenza, ghiandola-dipendente. In
vivo, in un modello murino, è stato dimostrato che dopo l’inoculazione un piccolo numero
di sporozoiti entra nei capillari sanguigni, mentre un numero più elevato raggiunge i
linfonodi o rimane nel derma fino a 7 ore dopo l’iniezione (Amino et al., 2006). Inoltre,
alcuni dati sperimentali indicano che esposizioni ripetute a punture di zanzare non infette
(quindi unicamente alla loro saliva) inducono una risposta locale e sistemica che, in una
successiva infezione con Plasmodium yoelii, è in grado di contenere lo sviluppo del
parassita (Donovan et al., 2007). È evidente quindi come l’individuazione delle
componenti salivari in grado di indurre questo tipo di risposta potrebbe essere di grande
interesse per l’inclusione in vaccini multi-stage.
Un’ulteriore interessante possibilità applicativa è quella di sfruttare la risposta
anticorpale dell’ospite alla saliva di insetti ematofagi come possibile marcatore di
esposizione. A tale riguardo risultati incoraggianti sono stati ottenuti nel caso di proteine
salivari di vettori di leishmaniosi e del morbo di Chagas (Barral et al., 2000; Nascimento et
al., 2001). Recentemente è stato suggerito che la risposta anticorpale alla saliva di An.
gambiae possa rappresentare una misura del grado di esposizione a rischio di contrarre
malaria (Remoue et al., 2006). In questo studio condotto in Senegal su bambini di età
inferiore ai 5 anni è riportato che il livello di IgG anti-saliva aumenta con il grado di
esposizione a punture anofeliche (basso, medio, elevato). Inoltre, è stata osservata una
correlazione positiva tra livelli di IgG rilevati e il rischio di sviluppare la malattia nei tre
mesi successivi. La possibilità dell’uso della saliva quale marcatore di esposizione
potrebbe essere estremamente utile ma è limitato da alcuni importanti fattori. Innanzitutto
la saliva di An. gambiae, come quella di altre specie di zanzare e di altri artropodi
ematofagi, è una miscela complessa costituita da differenti proteine con un diverso grado
33

di immunogenicità. Inoltre è verosimile che possa esistere una certa cross-reattività con
proteine salivari di altre zanzare (o di altri artropodi ematofagi). Questa potenziale cross-
reattività, che resta ancora da valutare, potrebbe limitare notevolmente la significatività di
una determinata misurazione, complicandone notevolmente l’interpretazione. Da questo
punto di vista un grosso salto di qualità sarebbe rappresentato dall’individuazione di
singole proteine salivari immunogeniche da usare, in luogo della saliva in toto, per la
misurazione dei livelli di IgG nel siero. A questo riguardo l’analisi del trascrittoma salivare
di An. gambiae e di altre zanzare (Arcà et al., 2005; Ribeiro et al., 2007; Valenzuela et al.,
2003; Calvo et al., 2007; Arcà et al., 2007) ha consentito di individuare una serie di
proteine salivari tipiche di Anopheles, cioè assenti negli altri generi di culicidi e altri insetti
ematofagi (Tab. 3 da Lombardo et al., 2006; Ribeiro, Mans and Arcà, 2010). Queste
proteine, se immunogeniche, potrebbero essere adoperate quali sensibili e specifici
marcatori del grado di esposizione a punture di Anopheles, rappresentando quindi uno
strumento importante per stimare in modo rapido i livelli di esposizione a vettori di malaria
e il relativo rischio di trasmissione. Questo potrebbe rivelarsi particolarmente prezioso
soprattutto nei casi di analisi epidemiologiche in cui sia difficile acquisire con altre
modalità gli opportuni dati entomologici, come nel caso di situazioni con basse densità di
vettori.
34

protein or
protein family1 comment
D7 (8) D7 family of salivary
proteins
SG1 (6) SG1 family of salivary
proteins
expression other
pattern1, 2 anopheline3 sg (6), enr (2) + +
culicine 3
sg (3), enr (3) + -
gVAG Antigen 5 salivary protein enr + +
Mucins (3) salivary mucins sg/m + +
SG2 salivary protein SG2 sg/m + -
SG2a salivary protein SG2a sg/m + -
gSG5 salivary protein gSG5 sg - -
gSG6 salivary protein gSG6 sg + -
gSG7 salivary protein gSG7 enr + -
gSG7-2 salivary protein gSG7-2 enr + -
gSG8 salivary protein gSG8 sg - +
gSG9 salivary protein gSG9 sg/m + -
hyp 6.2 hypothetical salivary
protein 6.2
enr + -
hyp 6.3 hypothetical salivary
protein 6.3
sg/m - -
hyp 8.2 hypothetical salivary
protein 8.2
enr + -
hyp 10 hypothetical salivary
protein 10
sg/m + -
hyp 12 hypothetical salivary
protein 12
sg/m + -
hyp 15 hypothetical salivary
protein 15
enr + -
hyp 17 hypothetical salivary
protein 17
enr + -
30 kDa 30 kDa allergen enr + +
hyp 37.7 putative 37.7 kDa salivary
protein
sg + -
hyp 55.3 putative 55.3 kDa salivary sg/m + +
protein
cE5 Anophelin sg/m + -
Ag_Sal_peroxidase salivary peroxidase sg + +
Sal_serpro2 cub-domain protease sg - +
Sal_tryp_XII salivary trypsin (similar to sg - -
FXII)
apyrase Apyrase sg + +
5p_nuc 5’-nucleotidase enr + +
Ag_epoxy_hydrolase epoxide hydrolase enr - -
Sal_serpro1 trypsin-like serin protease enr - -
Sal_galectin salivary galectin enr - -
Ag_Sal_amy salivary amylase sg/m - +
Ag_Sal_maltase salivary maltase sg/m + +
Tabella 3 Lista di putative proteine secrete individuate nelle ghiandole salivari di An. gambiae.
1. Il numero in parentesi si riferisce al numero di geni presenti nella stessa famiglia.
2. il pattern di espressione è determinato mediante RT-PCR (Arcà et al., 2005): sg, presente esclusivamente
nelle ghiandole salivari di femmine adulte; enr, arricchite nelle ghiandole salivari di femmine adulte; sg/m,
ghiandole salivari di femmine adulte e maschi adulti.
35

3. + or -, presenza o assenza di sequenze omologhe nei trascittomi salivari di altre specie di zanzare
determinata mediante analisi blastp contro il database non–ridondante del NCBI.
1.7.3 gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6)
gSG6 (gambiae Salivary Gland protein 6) è una piccola proteina salivare di ~10 kDa che è
espressa specificamente nelle ghiandole salivari femminili e che nella sua forma matura,
cioè dopo rimozione del peptide segnale, misura 87 amminoacidi. gSG6 è espressa
specificamente nelle porzioni distali dei lobi laterali (Fig. 1.12) ed è secreta nella saliva
della zanzara, come suggerito non solo dalla presenza di un segnale secretorio, ma anche
da saggi di puntura su membrana e successiva rivelazione con anticorpi policlonali anti-
gSG6 (Lombardo et al., 2006).
Figura 1.12 Immunolocalizzazione di anticorpi anti-gSG6 su
ghiandole femminili di An. gambiae (Lombardo et al., 2009)
Mediante RNA interference (RNAi) è stato dimostrato che la diminuzione dei livelli della
proteina gSG6 comporta una riduzione della capacità di compiere il pasto di sangue da
parte della zanzara. In particolare, una riduzione dei livelli di gSG6 determina una
diminuzione dell’abilità di compiere il pasto di sangue in confronto a zanzare di controllo.
Infatti 6 giorni dopo il trattamento il numero di individui che aveva effettuato il pasto di
sangue dopo 10 minuti di esposizione all’ospite (cavia peruviana) era del 28% (17/60) per
zanzare iniettate con gSG6-dsRNA, 46% (27/61) per zanzare iniettate con DsRed-dsRNA e
del 66% per zanzare iniettate con soluzione fisiologica (Figura 1.13). Inoltre la
misurazione del tempo di probing, cioè dell’intervallo di tempo tra il momento in cui la
zanzara punge l’ospite e l’inzio dell’ingestione del sangue mostrava che le zanzare trattate
con gSG6-dsRNA richiedono circa il doppio del tempo per iniziare il pasto di sangue
rispetto alle zanzare non trattate (p

Figura 1.13 Effetto della deplezione di gSG6 sulla capacità di
compiere il pasto di sangue da parte di An. gambie. A.
Prevalenze di zanzare che hanno compiuto il pasto di sangue
(•)percentuale di non trattati;( ) trattati con dsRed-dsRNA;
trattati con gSG6-dsRNA( ). B. Tempo di probing in: (•)non
trattati;( ) trattati con dsRed-dsRNA; trattati con gSG6dsRNA(
)(Lombardo et al., 2009)
Effettuando ricerche nelle banche dati usando la sequenza proteica di gSG6 di An. gambiae
come query si vede che questa proteina è ristretta a specie del genere Anopheles ma è
assente nei trascrittomi salivari di culicini quali Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti e
Aedes albopictus (Arcà et al., 2007; Ribeiro et al., 2007, 2004). Nell’ambito delle
anofeline gSG6 mostra un’elevata percentuale di identità (99% -100%) con omologhi da
specie appartenti al complesso An. gambiae; la percentuale di identità scende a circa l’80%
nel confronto con omologhi da altre specie del subgenere Cellia, tra cui An. funestus (81%)
e An. stephensi (81%). Infine, l’ identità diminuisce ulteriormente (~70%) quando la
proteina di An. gambiae è confrontata con l’omologo dal vettore di malaria americano An.
freeborni, appartenete al gruppo Maculipennis, subgenere Anopheles (Fig. 1.14)
(Lombardo et al., 2009).
Figura 1.14 Allineamento delle sequenze anofeliche di gSG6.
La sequenza del peptide segnale è stata delineata dal box. In
grigio sono mostrati gli aminoacidici conservati nelle diverse
specie (Lombardo et al., 2009).
37

La precedente espressione in forma ricombinante della proteina SG6 da An.
gambiae nel lievito Pichia pastoris aveva permesso di ottenere delle indicazioni
preliminari riguardo alla sua immunogenicità (Poinsignon et al., 2008) ed incoraggiando la
sua produzione su larga scala per ulteriori indagini epidemiologiche.
1.7.4 Anophelin/cE5
Una altra proteina salivare Anopheles-specifica è l’anofelina (Anophelin/cE5), una piccola
proteina salivare di circa 8,6 kDa espressa nelle ghiandole salivari femminili di An.
gambiae ma in una certa misura anche nei maschi ed in altri tessuti (Arcà et al., 2005 e dati
non pubblicati). In seguito alla rimozione del peptide segnale la proteina, nella sua forma
matura, misura 80 amminoacidi e mostra il 32% di identità (26/80) con l’omonima proteina
di An. albimanus (Fig. 1.15).
Figura 1.15 Allineamento della sequenza aminoacidica
(rimossa del peptide segnale) di An. gambiae con l’omologa
di An. albimanus. (In giallo sono mostrati gli aminoacidi
conservati tra le due specie).
Dati in letteratura indicano che l’anofelina di An. albimanus è un potente inibitore della α-
trombina ed è quindi in grado di inibire la coagulazione del sangue (Valenzuela et al.,
1999; Francischetti et al., 1999). Infatti, la funzione principale della α-trombina è quella di
tagliare il fibrinogeno generando la fibrina e un coagulo insolubile. Inoltre regola
l’attivazione di fattori coinvolti nella cascata della coagulazione quali il fattore V, VIII, XI
e la proteina C. Il ruolo cruciale svolto dall’ α-trombina nei processi fisiologici della
coagulazione e negli eventi trombotici ha esercitato una pressione evolutiva negli
organismi ematofagi che ha portato alla selezione di molecole biologicamente attive in
grado di inibire la α-trombina. Inoltre, sono stati isolati inibitori della trombina anche dal
veleno di serpenti e dalle piante (Francischetti et al., 1999).
Confrontando le due sequenze dell’anofelina in figura 1.15, si osservano: una regione
altamente conservata all’estremità N-terminale (APQYA), aminoacidi conservati carichi
38

negativamente (D8, D13, E14, D18, D13 e E43) nella regione centrale ed una arginina (R53)
conservata all’estremità C-terminale. Queste corrispondenze hanno portato all’ipotesi che
l’anofelina di An. gambiae sia anch’essa un’inibitore della trombina, al pari dell’omologa
di An. albimanus (Valenzuela et al., 1999).
Mediante esperimenti di RNAi è stato dimostrato che l’anofelina di An. gambiae è
coinvolta effettivamente nel pasto di sangue. In particolare, zanzare sottoposte a
silenziamento genico mostrano, rispetto alle zanzare non trattate, sia una riduzione di circa
il 15% della capacità di compiere il pasto di sangue sia un aumento del tempo di probing
(rispettivamente p=0,03 e p=0,012). Questa minore tendenza all’alimentazione da parte
delle zanzare trattate potrebbe essere dovuta alla diminuzione del flusso di sangue nella
sede di inoculo giustificata dalla mancanza dell’inibitore α-trombinico (Das et al., 2010).
39

2 Scopo della tesi
Come ampiamente discusso nell’introduzione, durante il pasto di sangue la zanzara inietta
nell’ospite un cocktail di proteine salivari con svariate attività biochimico-farmacologiche
necessarie per l’efficace assunzione del sangue (Ribeiro et al., 2009). Allo stesso tempo,
però, alcune di queste molecole inducono nell’ospite una risposta immunitaria specifica
alla saliva. Tale risposta può essere sfruttata per valutare l’esposizione alle punture di
specie vettrici di patogeni come il plasmodio della malaria e quindi anche al rischio di
trasmissione di tali malattie. Tuttavia, l’utilizzo della saliva come marcatore sierologico
può comportare dei bias nelle stime dovuti alla sua natura che, essendo una miscela
complessa di proteine, può cross-reagire con antigeni di altri organismi ematofagi. Un
aspetto interessante, che sta emergendo dalla analisi comparativa dei trascrittomi salivari di
zanzare appartenenti ai generi Anopheles, Aedes, Culex e di altri insetti ematofagi, è la
possibilità di individuare proteine salivari esclusive del solo genere Anopheles. Queste
proteine, se immunogeniche, potrebbero rappresentare dei validi marcatori sierologici di
esposizione a punture anofeliche ed essere quindi estremamente utili nelle indagini
immuno-epidemiologiche di malaria.
Il mio progetto di dottorato si inquadra in uno studio finalizzato a identificare
proteine salivari di Anopheles gambiae da impiegare quali marcatori epidemiologici di
esposizione umana a punture di questa specie. In particolare, ho concentrato la mia
attenzione principalmente su gSG6, una piccola proteina salivare coinvolta nell’assunzione
del pasto di sangue (Lombardo et al., 2009).
Al fine di ottenere informazioni sulla validità di questo marcatore, sono stati affrontati i
seguenti punti:
1. valutare la sua immunogenicità
2. misurare i livelli anticorpali anti-gSG6 in individui esposti ad elevate densità
anofeliche
3. validarla come marcatore di esposizione a punture
Ho inoltre testato l’immunogenicità di un’altra proteina, l’anofelina, un inibitore α-
trombinico presente nella saliva di An. gambiae. Infine, è stata valutata la cross-reattività
tra gli omologhi gSG6 di An. gambiae e An. funestus.
L’importanza di questi confronti risiede nel fatto che queste due specie, insieme ad An.
arabiensis, rappresentano i tre principali vettori afrotropicali di malaria. Di conseguenza, è
di fondamentale importanza comprendere la cross-reattività della risposta anticorpale alle
40

diverse gSG6, così come all’anofelina, al fine di poter mettere a punto efficaci protocolli di
esposizione alle punture di queste tre specie.
41

3.1 Area di studio e popolazione
3 Materiali e Metodi
Il Burkina Faso, situato nell’Africa Occidentale, è uno degli Stati più poveri del mondo,
con un prodotto interno pro capite tra i dieci più bassi in ordine mondiale e un economia di
tipo prevalentemente rurale. Il paese conta circa 13 milioni di abitanti di cui il 46% ha età
compresa tra 0 e 14 anni. L’aspettativa di vita media è di 44,2 anni e la mortalità infantile è
di circa l’8%. La distribuzione della popolazione e l’andamento economico sono
profondamente influenzati dall’impatto delle malattie infettive e dalla desertificazione. Il
paese è abitato da circa 60 gruppi etnici di cui i sette principali sono: Mossi (più del 40%),
Gurunsi, Senufo, Lobi, Bobo, Mande e i Fulani (www.cia.gov/library/publications/the-
world-factbook/geos/uv.html).
I sieri sono stati raccolti durante sette inchieste trasversali svolte in tre anni successivi
(1994, 1995, 1996) e comprendono sia la stagione delle piogge (Agosto e Ottobre), di alta
trasmissione malarica, che la stagione secca (Marzo) di bassa trasmissione. I campioni di
sangue sono stati raccolti in due villaggi a 35km a nord-est di Ouagadougou (Burkina
Faso) e distanti tra loro 5 km, Barkoundouba e Barkoumbilen (Fig. 3.1). L’area si estende
nel “plateau Mossi”, nella fascia eco-climatica di savana sudanese. La popolazione presa in
esame appartiene a 2 gruppi etnici: Mossi e Fulani. Quest’ultimi, noti come Peulh e
residenti a Barkoundouba, mostrano un background genetico e culturale ben distinto da
quello dei Mossi. Sono pastori nomadi in parte stanziali caratterizzati da tratti non negroidi
di possibile origine caucasoide. Invece, il gruppo etnico dei Mossi proveniente dal
villaggio Barkoumbilen, è una popolazione negroide Sudanese tradizionalmente dedita
all’agricoltura e con una lunga tradizione nell’allevamento stanziale.
42

Figura 3.1 Area di studio
Il campione analizzato in questa tesi consiste complessivamente di 2066 individui. Per
ciascun individuo sono state registrate informazioni relative a età e sesso. Prima
dell’ultima stagione di trasmissione della malaria (che in quest’area va da maggio a
ottobre), esattamente nel mese di giugno del 1996, sono state distribuite a tutta la
popolazione di entrambi i villaggi zanzariere impregnate di permetrina (concentrazione di
1g/m 2 ). Come controllo negativo sono stati usati i sieri di 60 individui di età compresa 1-77
anni recatesi in un noto ospedale romano per analisi ematiche di routine e il cui livello di
esposizione alle punture anofeliche è scarso o addirittura nulla.
3.2 Osservazioni entomologiche
Per ogni inchiesta è stata monitorata e stimata la presenza di zanzare Anopheles vettrici di
malaria presenti in ciascun villaggio. Sono state effettuate catture con insetticidi piretroidi
all’interno delle abitazioni in tre giorni successivi per ciascun mese, da agosto a novembre
1994, a marzo 1995 e da luglio a ottobre per il 1995 e il 1996. Mediante i metodi
immunoenzimatici è stato stimato l’indice di positività alla proteina circumsporozoitica
(CSP) di P.falciparum e l’indice del pasto di sangue umano sulle zanzare raccolte (An.
gambiae e An. funestus). Quindi è stato calcolato il tasso di inoculazione entomologico
moltiplicando l’indice sporozoitico e l’indice del pasto di sangue umano, il prodotto è stato
a sua volta moltiplicato per il numero di zanzare che hanno compiuto il pasto di sangue
nella stanza di cattura e infine il valore derivante è stato suddiviso per il numero di persone
che dormivano nella stessa stanza (Modiano et al., 1998). Le densità anofeliche in ciascuna
inchiesta sono state calcolate dividendo il numero di zanzare raccolte all’interno
dell’abitazione per il numero di occupanti.
43

3.3 Espressione e purificazione di proteine salivari
L’espressione e la purificazione delle proteine salivari sono state eseguite dal Dott.
Raffaele Ronca del Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, Università Federico
II di Napoli. Sia la procedura di espressione che di purificazione sono riportate in dettaglio
in Rizzo et al., 2011.
3.4 ELISA
La tecnica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), che consente di
rivelare complessi antigene-anticorpo, è stata impiegata per verificare la presenza di
anticorpi contro le tre proteine salivari: gSG6 e l’anofelina di An.gambiae e gSG6 di
An.funestus. L’adsorbimento è stato effettuato depositando 50 µl di antigene diluito in
coating buffer (15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, 3mM NaN3, pH 9.6) sul fondo dei
pozzetti di una micropiastra da 96 (Nunc, Multiwell immune plate Maxisorp, M9410 ).
Dopo un’ incubazione over night a 4°C è stato eseguito un lavaggio con PBST (1x PBS,
0.05% Tween 20) e altri tre con acqua distillata per allontanare l’eccesso di antigene non
legato. Successivamente, al fine di saturare i siti liberi, si è provveduto ad una incubazione
di 3 ore a temperatura ambiente con 150 µl di blocking buffer [1% (w/v) latte in polvere
(Marvel) in PBS-T] seguita da altri 4 lavaggi con PBST e acqua distillata. La reazione
antigene-anticorpo è stata fatta avvenire aggiungendo in ciascun pozzetto 50 µl di siero
diluito in Blocking buffer. Ciascun siero è stato testato in duplicato e in un terzo pozzetto
senza antigene. Le piastre sono state incubate overnight a 4°C e quindi lavate di nuovo con
PBST e acqua distillata per eliminare l’eccesso di anticorpi non legati. La rilevazione del
complesso antigene-anticorpo è stata effettuata mediante incubazione per 3 ore a
temperatura ambiente con 100 µl di anticorpo secondario diluito in Blocking buffer. Dopo
aver effettuato 3 lavaggi con PBST si è provveduto all’aggiunta di 100 µl di o-
phenylenediamine dihydrochloride (OPD Sigma #P8287) in 0.05 M di soluzione citrato-
fosfato (pH 5.0) contenente H2O2. Dopo 15 minuti di incubazione al buio e a temperatura
ambiente la reazione colorimetrica è stata bloccata mediante l’aggiunta di 25 µl di H2SO4
2M. A questo punto la presenza del complesso antigene-anticorpo è stata quantificata
mediante lettura della piastra a 492 nm. Nella Tab. 4, sono riportate le concentrazioni degli
antigeni e le diluzioni di anticorpi primari e secondari utilizzati per ciascun esperimento.
44

Ig Antigene [Ag] Diluzione AbI Diluzione AbII
IgG
IgG1
IgG4
Anofelina
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml * 1:100
gSG6 An. funestus 10 µg/ml 1:100
gSG6 An. gambiae
+ gSG6 An.
funestus
5 µg/ml
+
5 µg/ml
1:100
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20
gSG6 An. gambiae 10 µg/ml 1:20
Anofelina An.
gambiae
5µg/ml 1:100
1:5000
Anti human-IgG
HRP (Dako P0214)
1:5000
Anti human-IgG
HRP (Dako P0214)
1:5000
Anti human-IgG
HRP (Dako P0214)
1:1000
Anti human IgG1 e
IgG4 (Binding Site
AP006)
1:1000
Anti human IgG1 e
IgG4 (Binding Site
AP009)
1:5000
Anti human-IgG
HRP (Dako P0214)
Tabella 4 Concentrazioni degli antigeni e diluzioni dei sieri utilizzati nelle diverse indagini sperimentali
([Ag]= Concentrazione antigene; Ab I= anticorpo primario; Ab II= anticorpo secondario; * nell’analisi
comparativa con l’anofelina la concentrazione di gSG6 utilizzata per il coating era di 5 µg/ml).
3.5 Analisi statistica
I livelli di anticorpi IgG anti gSG6, espressi come OD finali, sono stati calcolati per
ciascun siero come il valore medio della densità ottica per i pozzetti con l’antigene a cui è
stato poi sottratto il valore OD senza antigene. Quando il coefficiente di variazione nei
duplicati dei sieri è risultato superiore al 20% questi sono stati esclusi dall'analisi. La
variazione intra e inter-specifica del saggio è risultata al di sotto del 20% dei valori medi
dei controlli.
La soglia di sieropositività è stata calcolata come media delle densità ottiche dei sieri di
controllo +3 deviazioni standard. Le differenze stagionali dei livelli di IgG sono state
calcolate mediante il test non parametrico di Kruskal-Wallis corretto con il Dunn’s post
test per comparazioni multiple. Le differenze dei livelli anticorpali tra gruppi indipendenti
è stata effettuata con il test di Mann-Whitney. Le comparazioni di frequenze sono state
45

comparate mediante test del Chi-quadro. I programmi utilizzati per l’analisi statistica sono
stati i seguenti: Statistica 8 (StatSoft Inc, Tulsa, USA) e GraphPad Prism 5.0 (GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA).
46

4 Risultati e discussioni
4.1 Espressione e purificazione di gSG6 di An. gambiae
Come precedentemente menzionato, la proteina salivare gSG6 è stata espressa dal Dott. R.
Ronca presso il Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale dell’Università Federico
II. Per completezza vengono qui riportati i passaggi principali dell’espressione e
purificazione della proteina in E. coli.
Dopo induzione dell’espressione con IPTG, la presenza della proteina è stata verificata
mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS. Come è possibile
osservare in Fig. 4.1 la proteina è presente in abbondanza nel campione (banda a circa
13kDa).
Figura 4.1 Analisi dell’espressione di gSG6 in E.coli
(Un=campione non indotto; Ind= campione indotto; MW=
marcatore di peso molecolare).
La solubilità della proteina è stata verificata mediante sonicazione ed analisi delle frazioni,
solubile ed insolubile. La proteina gSG6 è risultata presente nella porzione insolubile e di
conseguenza è stato necessario solubilizzarla con agenti denaturanti. Una volta isolata dai
corpi di inclusione è stata sottoposta a cromatografia d’affinità in condizioni denaturanti ed
il grado di purificazione di gSG6 dopo cromatografia d’affinità è mostrata nella Fig. 4.2.
47

Figura 4.2 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo
cromatografia d'affinità (AC= frazione di eluato; MW=
marcatore di peso molecolare).
Successivamente, le frazioni purificate sono state rinaturate e ulteriormente purificate
mediante cromatografia a scambio anionico (Fig. 4.3).
Figura 4.3 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo
cromatografia a scambio anionico (IEC= frazione di eluato; MW
marcatore di peso molecolare).
Infine la proteina è stata ulteriormente purificata mediante RP-HPLC (Reverse Phase High
Pressure Liquid Chromatography) per verificarne l’omogeneità come mostrato in Fig. 4.4
A, dove si vedono 2 picchi con tempi di ritenzione diversi. Il primo picco corrisponde ad
uno spike elettrico che si verifica ad inizio corsa cromatografica, dovuto ad un
cambiamento nella conduttanza conseguente al cambio di tampone. Il secondo picco
corrisponde invece alla proteina ricombinante gSG6. Infine, mediante spettrometria di
massa (Fig. 4.4B) è stato possibile identificare un picco principale corrispondente a una
massa di 12244.4 Da che corrisponde alla massa attesa per gSG6 ricombinante.
48

A B
Figura 4.4 (A) Analisi della frazione purificata di gSG6
mediante Reverse Phase HPLC; (B) Analisi della frazione
purificata mediante Spettrometria di massa.
4.2 Densità anofeliche nei due villaggi campionati
Le specie osservate all’interno delle abitazioni dei due villaggi sono An gambiae ed An
funestus. Quest’ultima, osservata con frequenze relative nettamente inferiori della prima, è
stata rilevata occasionalmente (ottobre 1994, marzo 1995 e ottobre 1995). Da questo dato
emerge come i soggetti utilizzati per il presente studio fossero esposti a punture
provenienti principalmente da An. gambiae (Fig. 4.5).
Figura 4.5 Densità di Anopheles gambiae e An. funestus.
Le densità di An. gambiae per persona per notte osservate non sono significativamente
diverse tra i due villaggi campionati per tutte le inchieste, fatta eccezione agosto 1994
(p=0.008), mentre si osserva una evidente variabilità stagionale. Infatti, le densità osservate
mostrano livelli elevati durante la stagione delle piogge (agosto-ottobre) e minimi durante
la stagione secca (marzo) del periodo 1994-1995. Al contrario, si osserva un netto calo
delle densità anofeliche durante il campionamento dei mesi di agosto e ottobre 1996.
49

Questa differenza, significativamente diversa dalle stagioni precedenti (p

del 58,5% (p=0,01) e del 94,5 % (p=0.001) di An. gambiae s.l. e di An. funestus che
avevano effettuato il pasto di sangue (Gimnig et al.,2003). I dati in bibliografia indicano
quindi che la riduzione delle densità anofeliche osservata nel nostro studio del 1996 era
effettivamente da attribuirsi all’applicazione delle zanzariere impregnate nei due villaggi di
studio.
4.3 Analisi della risposta IgG anti- gSG6 di An. gambiae
4.3.1 Immunogenicità di gSG6
Analizzando i livelli anticorpali anti gSG6 negli individui esposti e in quelli di controllo si
osserva una risposta significativamente maggiore (p

Sebbene la figura consideri i soli individui considerati “responders”, ovvero quei individui
il cui valore di OD è al di sopra del cut-off, la stessa analisi effettuata senza questa
distinzione mostra uno schema simile in tutti i periodi campionati. Bisogna inoltre tenere in
considerazione che, nonostante An. gambiae non sia presente nelle aree geografiche di
provenienza degli individui di controllo (città di Roma), questi ultimi potrebbero essere
esposti, presumibilmente a basso livello e principalmente nelle zone rurali piuttosto che
urbane, a punture provenienti da anofeli italiane appartenenti ad altre specie, come ad
esempio An. plumbeus o specie appartenenti al complesso An. maculipennis oppure ad altri
culicidi. Quindi, la risposta negli individui di controllo pressoché nulla conferma che in
persone non esposte a punture di An. gambiae non si ha alcuna cross-reazione con altre
proteine salivari.
È importante osservare come, anche durante i periodi a bassa esposizione a punture
(marzo), i soggetti esposti mostrino valori apprezzabili di OD. Questa osservazione
suggerisce che gSG6 potrebbe essere utilizzata efficacemente anche in contesti a bassa o
media esposizione a punture di An. gambiae, dove le stime basate sull’utilizzo dei metodi
tradizionali risultano di scarsa efficacia.
Osservando il valore di OD individuale per tutte le inchieste complessivamente si rileva
una eterogeneità nella risposta anticorpale (Fig. 4.8). I livelli di IgG anti gSG6 assumono
valori di OD che vanno da 0 a 1,8 mostrando un intervallo di risposta molto variabile.
Stabilendo la soglia di positività (descritta nel paragrafo 3.5) corrispondente a 0,133 OD, la
percentuale di non rispondenti è pari al 34% mentre i rispondenti rappresentano il 66%
della popolazione. Questo valore suggerisce che gSG6 è fortemente immunogenica e in
grado di stimolare una risposta immunitaria specifica nell’ospite. La variabilità riscontrata
nei valori di OD, così come la percentuale di non rispondenti all’interno del campione
analizzato, potrebbero essere dovuti a diversi fattori legati all’ospite come l’età, la stagione
di trasmissione e il gruppo etnico, che verranno presi in esame nei paragrafi successivi.
52

Figura 4.8 Distribuzione dei valori OD misurati in tutti gli
individui esposti.
4.3.2 Variazione del titolo anticorpale in accordo alla stagione di trasmissione
Come accennato nell’Introduzione, la trasmissione della malaria è strettamente legata a
fattori climatici quali la temperatura e le precipitazioni piovose. La temperatura influenza
direttamente il periodo di incubazione del parassita nel vettore, così come la durata dello
sviluppo larvale e del ciclo gonotrofico di quest’ultimo, mentre le precipitazioni svolgono
un ruolo cruciale nella determinazione della distribuzione e della dinamica di popolazione
delle specie vettrici, dato che lo sviluppo larvale di queste avviene in raccolte d’acqua
stagnante. In linea generale è quindi possibile affermare che i livelli di trasmissione della
malaria sono correlati alla stagionalità. In Burkina Faso, come in tutti i paesi delle fasce
ecoclimatiche di Savana Sudanese e Guineana dell’Africa sub-Sahariana, si distinguono
due stagioni: la stagione delle piogge (che va da maggio ad ottobre) e quella secca. In Fig.
4.9 è stato riportato il tasso di inoculazione entomologico (Entomological Inoculation Rate
o EIR) calcolato per le tre diverse inchieste e suddiviso per i due villaggi: Barkoumbilen e
Barkoundouba. Durante la stagione delle piogge del 1994, si osserva come la trasmissione
aumenta gradualmente da agosto ad ottobre per poi diminuire a novembre. Il livello si
abbassa notevolmente raggiungendo valori prossimi allo zero durante la stagione secca
(marzo ’95) per poi innalzarsi nuovamente durante la successiva stagione delle piogge
(1995). I livelli di trasmissione che si raggiungono in questo caso sono più bassi rispetto
alla stagione precedente, molto probabilmente a causa delle scarse precipitazioni
verificatesi nel 1995 (860 mm nel 1994, 609 mm nel 1995). Nel 1996 invece, si registrano
dei valori di EIR molto bassi (Modiano et al., 1998). Ciò è in accordo con quanto
precedentemente descritto per le densità anofeliche nel paragrafo 4.2. Infatti,
l’applicazione delle zanzariere impregnate di permetrina all’inizio della stagione di
53

trasmissione nelle due villaggi non solo comporta un abbassamento delle densità vettoriali
ma determina anche una riduzione della trasmissione all’interno dell’abitazione pari al
90% rispetto alle inchieste precedenti. Inoltre, confrontando i valori di EIR delle due etnie
provenienti dai due villaggi esaminati non si riscontrano differenze significative per quanto
riguarda tutte le tre inchieste.
Figura 4.9 Tasso di inoculazione entomogico misurato nelle 3
inchieste e stratificato per gruppo etnico (Modiano et al.,
1998).
L’analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare gSG6 nelle sette diverse inchieste
si mostra un andamento che varia in accordo con le stagioni di trasmissione. Come
mostrato in Fig. 4.10 la risposta IgG anti- gSG6 nei “responders” aumenta o persiste ad alti
livelli durante la stagione delle piogge, momento in cui le densità di Anopheles sono tali da
esporre l’individuo a frequenti e continue punture. Invece, durante la stagione secca si
assiste a una caduta significativa del titolo anticorpale, che si innalza nuovamente durante
la successiva stagione di trasmissione, evidenziando una dinamica temporanea della
risposta immunitaria alla proteina salivare. Questo fenomeno riveste un ruolo cruciale nella
prospettiva di utilizzare gSG6 (e più in generale le proteine salivari) come marcatori di
esposizione ad Anopheles, in quanto permette di seguire l’andamento temporale
dell’esposizione all’antigene salivare e quindi alle punture del vettore. È infatti importante
sottolineare che, dopo pochi mesi di bassa esposizione al vettore, la produzione di IgG
decresce in maniera significativa per poi riprendere nella stagione successiva quando la
stimolazione antigenica raggiunge livelli costanti ed elevati. Infatti, come è possibile
osservare dalla Fig. 4.10, i livelli anticorpali aumentano significativamente da marzo ad
agosto-ottobre 1995 (p

differenza nel titolo anticorpale tra periodi di diversa esposizione. Bisogna notare come
questa dipendenza della risposta immunitaria dell’ospite umano all’esposizione antigenica
di An. gambiae sia già stata descritta in lavori simili. In uno studio longitudinale di 8 mesi,
effettuato su un gruppo di 88 soldati francesi, è stata misurata la risposta anticorpale alla
saliva di An. gambiae prima, durante e al ritorno da un viaggio in paesi dell’Africa
tropicale. I livelli di IgG anti-saliva aumentavano nel 41% degli individui durante il
periodo di soggiorno (p

percentuale di responders rimane alta durante questa stagione probabilmente a causa di un
livello basale di esposizione della popolazione dovuto a punture di Anopheles all’esterno
delle abitazioni durante le ore serali.
Figura 4.11 Percentuali di responders nelle 7 inchieste
(wiskers: 95% intervallo di confidenza; i valori di p sono stati
calcolati mediante test del Chi Quadro e corretti secondo il
metodo Yates; **, 0,001< p

Figura 4.12 Livelli di OD nei responders appartenenti ai due gruppi
etnici nelle 7 inchieste (M=Mossi; F=Fulani; box: 25%-75%; wiskers:
5%-95%; linea: mediana; punti:outlier; i valori di p sono stati calcolati
mediante Mann-Whitney U test; *, p

Figura 4.13 Percentuali di responders nei due gruppi etnici e
nelle 7 inchieste (M=Mossi; F=Fulani; wiskers: 95% intervallo
di confidenza; i valori di p sono stati calcolati mediante test
del Chi-quadro; **, 0,001< p

e 1995) si assiste ad un aumento significativo della percentuale dei responders (p

(Modiano D et al., 1996,1998,1999; Luoni et al., 2001). Risultati simili sono stati ottenuti
in uno studio condotto tra il 1998 e il 2000 in 4 villaggi del Mali, abitati da due gruppi
etnici: Fulani e Dogon. I livelli di IgM, IgE, IgG, IgG1 e IgG3 per estratti di parassita nella
forma di schizonte sono risultati molto più elevati per i Fulani rispetto ai Dogon (Dolo et
al., 2005, Bolad et al., 2005). Inoltre, questa forte risposta immunitaria osservata nei Fulani
non si limita solo agli antigeni di P. falciparum bensì anche ad altri agenti patogeni. In
particolare è stata riscontrata una risposta umorale maggiore a Toxoplasma gondii e al
Morbillivirus (agente eziologico del morbillo) nei Fulani quando questi sono stati
confrontati con gruppi simpatrici del Burkina Faso e del Mali (Bolad et al., 2005). Infine,
sempre confrontando i Fulani con le altre etnie simpatriche provenienti dal Burkina Faso,
sono stati rilevati nei Fulani alti livelli anticorpali ad antigeni di Schistosoma
haematobium, HBV (virus dell’epatite B) e Cytomegalovirus (Modiano D., dati non
pubblicati). Questa forte risposta immunitaria verso i differenti antigeni potrebbe essere
dovuta ad alcuni mediatori cellulari o solubili della risposta innata e della risposta Th1 o
Th2, o ancora coinvolgere le cellule T regolatorie (Treg).
Per verificare tali ipotesi sono state effettuate delle analisi di espressione di geni correlati
alla risposta Th1 (cellulo-mediata) e Th2 (umorale) delle cellule mononucleate del sangue
periferico di Mossi e Fulani provenienti dal Burkina Faso. L’analisi ha mostrato che la
maggior parte dei geni presi in considerazione rivelano un maggiore profilo di espressione
nei Fulani rispetto ai Mossi. I geni maggiormente espressi sono citochine e fattori di
trascrizione correlati alla risposta Th1 (INF-gamma, IL-18) e Th2 ( IL-4, IL-9 GATA-3).
Tuttavia, nei Fulani si osserva una ridotta espressione dei geni FOXP3 e CTLA4 che
svolgono un ruolo importante nella tolleranza immunologica. La ridotta espressione di
FOXP3 nelle cellule mononucleate del sangue dei Fulani coinvolge direttamente l’attività
delle cellule Treg suggerendo che l’elevata risposta Th1 e Th2 riscontrata nei Fulani possa
essere collegata ad alterazioni della risposta immunosoppressiva mediata da questo tipo
cellulare (Torcia et al., 2008).
Le cellule T regolatorie, infatti, giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta
immunitaria ai patogeni e nel mantenimento dell’omeostasi immunologica in quanto
responsabili dei meccanismi di immunosoppressione e del riconoscimento di antigeni
autologhi e non. Le Treg sono prodotte naturalmente nel timo o negli organi linfoidi
secondari in risposta ad antigeni esogeni. Esprimono le glicoproteine di membrana CD4 e
CD25 e dopo attivazione esprimono il fattore di trascrizione FOXP3, cruciale per il loro
sviluppo e la loro funzione. Il loro effetto immunosoppressivo avviene attraverso il
60

contatto cellulare e/o produzione di citochine down regolatorie quali IL-10 e TGF-beta
(Janeway, 2005). Nelle infezioni parassitarie, le Treg limitano l’entità della risposta
effettrice riducendo in questo modo il danno tissutale ma nello stesso tempo favoriscono la
sopravvivenza del patogeno (Belkaid et al., 2006).
L’analisi dei profili di espressione di geni correlati alla funzione delle Treg in cellule
CD4+ e CD25+ di Mossi e Fulani, hanno dimostrato che quest’ultimi presentano una bassa
espressione di geni cruciali per l’attività delle Treg. In particolare, i Fulani mostrano bassi
livelli di espressione della citochina TGF-beta, del recettore CTLA-4 e di FOXP3 (Torcia
et al., 2008), suggerendo che, per quest’etnia, l’attività regolatoria potrebbe essere
inefficiente o addirittura assente.
4.3.4 Variazione del titolo anticorpale con l’età
La risposta IgG anti-gSG6 è stata analizzata in relazione all’età dei soggetti testati. Il
campione esaminato è stato diviso in cinque gruppi di età, così ripartiti: 1-5 anni (a cui mi
riferirò nella successiva discussione come gruppo 1), 5-10 anni (gruppo 2), 10-20 anni
(gruppo 3), 20-40 anni (gruppo 4) e >40 anni (gruppo 5). Dall’analisi è emerso un
andamento simile per entrambi i gruppi etnici, con una diminuzione progressiva del titolo
anticorpale in funzione dell’avanzamento dell’età. Come mostrato in Fig. 4.16, la risposta
ha inizio in età precoce e si mantiene a livelli elevati fino a circa 10 anni per poi diminuire
progressivamente e raggiungere livelli più bassi negli anziani. Tuttavia, la risposta non
scende mai al di sotto di quella osservata nei gruppi di controllo. A differenza dei Mossi, i
Fulani rivelano una forte risposta anticorpale anti-gSG6 nei primissimi anni di vita (1-5
anni) e il titolo anticorpale diminuisce in modo più marcato con l’aumento dell’età. Questo
andamento, mostrato in Fig. 4.16 per Agosto 1994, è simile con piccole variazioni anche
in tutte le altre stagioni esaminate.
61

Figura 4.16 Variazione dei livelli di OD fra i responders in
funzione dell'età (Agosto 1994) (M=Mossi; F=Fulani; box:
25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea: mediana; punti:outlier).
Analizzando per ciascuna inchiesta la percentuale di responders nei 5 gruppi di età si
osserva un trend molto simile. Per ciascuna stagione, la prevalenza dei responders
diminuisce con l’aumento dell’età raggiungendo valori minimi intorno al 20% nel gruppo 4
(Fig. 4.17 e 4.18). Le prevalenze dei Fulani nei primi due gruppi di età sono marcatamente
più alte rispetto a quelle dei Mossi. In particolare, la percentuale dei responders nei
bambini al di sotto dei 10 anni di età supera per la maggior parte delle stagioni l’80% con
uno scarto percentuale del 20% (Fig. 4.18). Nei Mossi, invece, si osserva una maggiore
variabilità stagionale con prevalenze nettamente al di sotto dell’80% osservato per i Fulani
(Fig. 4.17). Nonostante ciò i Mossi mostrano, a differenza dei Fulani, una maggiore
variabilità di risposta in funzione della stagione in tutti i gruppi di età.
62

110%
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
110%
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Mossi
0-5 5-10 10-20 20-40 >40
Figura 4.17 Variazione stagionale della percentuale dei
responders nel gruppo etnico dei Mossi in funzione dell’ età
Fulani
0-5 5-10 10-20 20-40 >40
Figura 4.18 Variazione stagionale della percentuale dei
responders nel gruppo etnico dei Fulani in funzione dell’ età
Ago '94
Ott '94
Mar '95
Ago '95
Ott '95
Ago '96
Ott '96
Ago '94
Ott '94
Mar '95
Ago '95
Ott '95
Ago '96
Ott '96
Questa suddivisione in cinque gruppi ha permesso di osservare le differenze tra le classi di
età in intervalli molto ristretti, tuttavia il basso numero di individui non permette in alcuni
casi di effettuare una analisi statistica attendibile. Dal momento che è stata osservata una
differenza, sia di riposta anticorpale che di prevalenza, tra i primi 2 gruppi di età e i restanti
3 gruppi, si è deciso di dividere il campione esaminato in 2 gruppi principali: 1-10 (gruppo
a) e >20 (gruppo b) anni. In questo modo è stato possibile verificare eventuali differenze
63

statistiche tra i due gruppi di età. Nella Tab. 5, è stato riportato, per ciascuna inchiesta, la
mediana dei valori OD fra i responders e la prevalenza suddivisi per gruppo di età e per
etnia, nonché il valore p di significatività statistica calcolata. In tutte le stagioni si
osservano livelli anticorpali anti-gSG6 più alti nei bambini rispetto agli adulti. Inoltre, in
otto casi su quattordici le differenze sono statisticamente significative. La differenza di
risposta tra i due gruppi si evidenzia maggiormente analizzando le prevalenze. In quasi
tutte le inchieste la percentuale dei responders è superiore nei bambini, eccetto nel mese di
Marzo 1995 in cui si registra un valore simile nei due gruppi. Le differenze sono
statisticamente significative in dieci casi su quattordici.
stagione etnia Mediana OD prevalenze
Ago ‘94
Ott ‘94
Mar ‘95
Ago ‘95
Ott ‘95
M 0,614
(46)
F 0,714
(44)
M 0,535
(52)
F 0,686
(18)
M 0,290
(20)
F 0,661
(27)
M 0,592
(75)
F 0,646
(53)
M 0,519
(77)
F 0,925
(45)
1-10 (n) >20 (n) p M 1-10 (n) >20 (n) p C
0,242
(27)
0,298
(18)
0,327
(20)
0,342
(11)
0,229
(15)

Ago ‘96
Ott ‘96
M 0,414
(23)
F 0,958
(20)
M 0,505
(21)
F 0,718
(55)
0,405
(10)
ns 0,72 (32) 0,37 (27) 0,0154
0,379 (7) ns 1 (20) 0,41 (17)

Figura 4.19 Prevalenze e livelli anticorpali contro alcuni
antigeni di Plasmodium falciparum in Mossi e Fulani
(Modiano, 1999)
Al contrario, ci sono pochi dati in letteratura che descrivono la risposta anticorpale alla
saliva e/o proteine salivari di An. gambiae in funzione dell’età. Per quanto riguarda la
risposta umorale alla saliva di An. gambiae, sono stati misurati i livelli di anticorpi del tipo
IgG in sieri di bambini senegalesi da 2 mesi a 5 anni di età, evidenziando che il titolo
66

anticorpale diminuisce gradualmente a partire da 1 anno di età (Fig. 4.20) (Remoue F et
al., 2006).
Figura 4.20 Livello di anticorpi IgG antisaliva in funzione
dell’età in bambini senegalesi (Remoue et al.,2005).
In uno studio successivo, gli stessi autori hanno misurato i livelli di anticorpi specifici IgG
in bambini del Senegal di età compresa tra 6 mesi e 5 anni utilizzando, al posto della
saliva, un peptide di gSG6 di An. gambiae: gSG6-P1. Il trend osservato nei bambini è
simile a quello riscontrato precedentemente utilizzando la saliva come antigene. L’analisi
effettuata anche su bambini di età compresa tra 2 e 12 mesi di età ha permesso di
evidenziare la presenza di elevati livelli di IgG specifiche in questa fascia di età. Dal
momento che i bambini vengono maggiormente protetti con zanzariere dalle loro madri, è
possibile che, almeno in parte, l’elevata presenza di anticorpi anti- gSG6-P1 sia dovuta a
trasferimento passivo da madre a figlio durante la gravidanza e/o l’allattamento. E’ noto,
infatti, che le IgG materne possono persistere nel sangue del bambino fino a nove mesi
dopo la nascita ( Grindstaff et al., 2003).
L’andamento della risposta anticorpale in funzione dell’età osservata nei nostri esperimenti
trova riscontro anche in studi precedenti condotti su Aedes vexans. In particolare, sono stati
misurati i livelli di IgE e IgG specifici ad estratti salivari in 1460 canadesi di età compresa
tra 1 mese e 70 anni. I livelli di IgG raggiungono livelli elevati precocemente, intorno a 1-6
mesi di età. Successivamente, il titolo anticorpale diminuisce gradualmente dopo i 5 anni
67

di età e il livello raggiunto intorno ai 20 anni è simile a quello poi osservato negli adulti
(Fig. 4.21) (Peng and Simons, 2004).
Figura 4.21 Livelli anticorpali anti-saliva di Ae. Vexans in
funzione dell’età (Peng and Simons, 2004)
È stato ipotizzato che questo descrescendo della risposta anticorpale con l’età sia correlato
ad una naturale desensitizzazione dovuta a ripetute e prolungate esposizioni alle punture.
Infatti, le reazioni cutanee umane a punture di zanzara sono state classificate in 5 fasi
(Mellanby, 1946) che coinvolgono diversi meccanismi immunologici, alcuni dei quali si
sovrappongono. Le fasi sono così suddivise:
Fase 1: gli individui che non sono mai stati esposti ad una determinata specie di zanzara
non mostrano reazioni in seguito alla prima puntura. Ci sono molte indicazioni che
dimostrano la necessità di un periodo di sensitizzazione alla puntura di zanzara prima di
sviluppare una reazione cutanea. I primi studi effettuati da Dubin e collaboratori nel 1948
dimostrarono che estratti totali di An. quadrimaculatus erano in grado di stimolare una
risposta immediata nei conigli e Hudson 10 anni più tardi (1958) mostrò che erano
necessarie 12 punture di Ae. aegypti per indurre la risposta nel coniglio. Heilesen (1949)
confermò nei bambini quanto visto da Mellanby negli adulti, dimostrando che, se questi
non sono mai stati esposti ad Ae. aegypti, la prima puntura non determina lo sviluppo di
una reazione ma che sono necessari un paio di giorni. Infine, Brummer-Korvenkontio
(1990) dimostrò che dopo 40-60 punture di Ae. aegypti la produzione di IgG coincideva
con il manifestarsi delle reazioni cutanee.
68

Fase 2: in pochi giorni, e dopo altre punture, si manifesta una reazione ritardata. A tal
riguardo esperimenti in vitro condotti da Peng e collaboratori (1996b) con estratti di
ghiandole salivari di Ae. Vexans, hanno dimostrato che in soggetti con una reazione
ritardata, la proliferazione linfocitaria è maggiore. Questo dato è stato ulteriormente
confermato da Simons e Peng (2001) che per i loro studi hanno utilizzato allergeni
ricombinanti della saliva di Ae. aegypti.
Fase 3: in seguito a ripetute punture si sviluppa una reazione immediata a cui fa seguito
una riduzione del periodo di latenza precedente alla reazione ritardata (McKiel and West,
1961). Questa fase appare a pochi minuti dalla puntura e raggiunge nell’uomo il livello
massimo in 15-30 minuti (McKiel, 1959). La reazione consiste in un ponfo circondato da
un alone eritematoso e accompagnato da prurito. Diversi studi hanno dimostrato che questo
tipo di reazione è mediato da anticorpi di tipo IgE ed IgG e da istamine (Brummer-
Korvenkontio et al., 1994; Peng et al., 1995, 1996a; Reunala et al., 1994; Horsmanheimo
et al., 1996). In particolare, sono state identificate delle IgG specifiche appartenenti alle
sottoclassi IgG1 e IgG4 (Reunala et al., 1990, 1994; Brummer-Korvenkontio et al., 1994).
Sebbene sia ancora da chiarire il ruolo svolto dalle IgG specifiche è stato ipotizzato una
correlazione con lo sviluppo della risposta cutanea (Wilson and Clements, 1965) oppure
che possano essere coinvolte nello sviluppo della reazione allergica, probabilmente
attraverso un meccanismo locale di ipersensibilità mediata da complessi antigene (della
zanzara) e anticorpi specifici (Peng et al., 1996b).
Fase 4: dopo successive esposizione, scompare la risposta ritardata e persiste soltanto una
reattività di tipo immediato.
Fase 5: individui ripetutamente esposti per un lungo periodo a elevato numero di punture
possono sviluppare tolleranza e non mostrare più una risposta cutanea. In uno studio
prospettico, Peng e collaboratori, hanno sottoposto un individui, fino ad allora mai esposto
a Cx. quinquefasciatus, a 100 punture ogni 2 settimane per 48 settimane. I risultati hanno
dimostrato che la risposta ritardata e immediata si sviluppa verso la terza settimana,
raggiungendo livelli elevati tra la 5-19 a settimana e scompare alla 26 a settimana insieme
alla risposta IgE e IgG (Peng and Simons, 1998). Questi risultati suggeriscono che
l’andamento decrescente della risposta IgG-anti gSG6 in funzione dell’età possa essere
correlata al fenomeno di desensitizzazione che probabilmente avviene durante l’infanzia e
l’adolescenza (16-18 anni).
69

4.4 Analisi delle sottoclassi IgG1 e IgG4 anti- gSG6 di An. gambiae
Come precedentemente descritto, durante la fase di sensitizzazione vengono prodotti
diversi isotipi anticorpali contro la saliva di zanzara, tra cui le IgE e le IgG. Inoltre, diversi
studi dimostrano la produzione e quindi la presenza di specifiche sottoclassi di IgG in
seguito all’esposizione a punture di insetti ematofagi. In particolare, sono state rilevate le
sottoclassi IgG1 e IgG4 in risposta alla saliva sia di Triatoma infestans, responsabile della
malattia di Chagas (Nascimento et al., 2001), sia di Aedes vexans (Simons and Peng,
1999) sia di Ae. communis (Brummer-Korvenkontio et al., 1994). Dal momento che i dati
in letteratura si riferiscono alla specificità di questi anticorpi verso la saliva o gli estratti
salivari, abbiamo ritenuto opportuno verificare la presenza di una risposta specifica delle
sottoclassi di IgG alla proteina salivare gSG6 di An. gambiae. La misurazione dei livelli di
IgG1 e IgG4 è stata effettuata su un sottocampione della popolazione del Burkina Faso,
costituito da individui appartenenti ad entrambi i gruppi etnici classificati nell’analisi
precedente come responders a gSG6 e che sono stati campionati per tre inchieste
consecutive: Agosto 1994, Ottobre 1994 e Marzo 1995.
4.4.1 Variazione stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4
Sono stati confrontati i livelli di IgG1 e IgG4 per ciascuna inchiesta suddividendo il
campione per etnia. Come mostrato in figura 4.22, entrambe le sottoclassi esibiscono, in
generale, una variazione del titolo in accordo alla stagione di trasmissione; in accordo con
quanto già visto e discusso in precedenza questa variazione è evidente nei Mossi e non nei
Fulani. In particolare, mentre nei Fulani i livelli di IgG1 non mostrano delle differenze
stagionali, nei Mossi si rileva una differenza statisticamente significativa del titolo
anticorpale tra la stagione delle piogge (alta trasmissione) e la successiva stagione secca
(bassa trasmissione) (Agosto 1994-Marzo 1995, p

Figura 4.22 Andamento stagionale dei livelli di IgG1 e IgG4
anti gSG6 nei due gruppi etnici, Mossi e Fulani (linea:
mediana; i valori di p sono stati calcolati mediante Kruskal-
Wallis test; i confronti multipli sono stati corretti secondo il
metodo di Dunn;**, 0,001< p

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Mossi Fulani
Ago ‘94 Ott ‘94 Mar ’95
(60) (56) (32)
IgG1
IgG4
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
**
*** ***
Ago ‘94 Ott ‘94 Mar ’95
(63) (30) (29)
Figura 4.23 Differenze dei livelli di IgG1 e IgG4 in ciascuna
inchiesta ed etnia (box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; punto:
mediana; i valori di p sono stati calcolati mediante Mann
Whitney; **, 0,001< p

emerge che le IgG4 sono associate a diverse condizioni cliniche. Alcune di queste
associazioni suggeriscono un effetto protettivo nell’immunoterapia allergene specifica ma
anche nell’induzione della tolleranza (Ruiter et al., 2007). Sono state ipotizzate due
modalità con cui le IgG4 possono indurre il fenomeno della desensitizzazione:
intervenendo come anticorpi bloccanti oppure interferendo con la presentazione facilitata
dell’allergene alle IgE (Aalberse et al., 2009). Nel primo caso le IgG4 risultano dotate di
una notevole affinità per l’allergene specifico, al quale sono in grado di legarsi in
competizione con le IgE. Sono pertanto definite “bloccanti”, poiché impediscono
all’allergene di raggiungere la cellula bersaglio a livello dell’organo di reazione, inibendo
l’attivazione mastocitaria e il rilascio di mediatori. Il secondo meccanismo prevede
l’interferenza delle IgG4 con il meccanismo di presentazione dell’antigene alle IgE.
Normalmente, in presenza di cellule presentanti l’antigene (APCs) dotate di recettori per le
IgE, la dose di allergene richiesta per l’attivazione delle cellule T da parte delle IgE
mediante APC è molto bassa. Tuttavia, quando i livelli di IgG4 sono elevati questo
meccanismo viene impedito, molto probabilmente a causa della competizione con le IgE
(Aalberse et al., 2009).
4.4.2 Differenze inter-etnica dei livelli di IgG1 e IgG4
Le differenze inter-etniche dei livelli di IgG1 e IgG4 sono state analizzate stratificando il
campione per il gruppo etnico in ciascuna inchiesta. Come si può osservare in Fig. 4.24, la
produzione di IgG1 anti-gSG6 è molto simile nei due gruppi etnici per le due stagioni di
alta esposizione/trasmissione (Agosto 1994 e Ottobre 1994) mentre è significativamente
diversa per la stagione di bassa esposizione/trasmissione, in cui i Fulani mostrano livelli di
IgG1 anti-gSG6 superiori rispetto a quelli dei Mossi (Marzo 1995, p=0,018; Mann-
Whitney test). Invece, le IgG4 mostrano valori di mediana più elevati nei Fulani in tutte e
tre le inchieste con differenze statisticamente significative rispetto ai Mossi per Agosto
1994 (p=0,02; Mann-Whitney test) e Marzo (p

Figura 4.24 Confronto inter-etnico dei livelli di IgG1 e IgG4
anti -SG6 in ciascuna stagione (i valori di p sono stati calcolati
mediante il test di Mann- Whitney).
4.4.3 Variazione dei titoli di IgG1 e IgG4 con l’età
La risposta IgG1 e IgG4 anti-gSG6 è stata analizzata in relazione all’età degli individui
testati. Il campione esaminato è stato diviso in cinque gruppi di età, così ripartiti: 1-5 anni,
5-10 anni, 10-20 anni, 20-40 anni e >40 anni. Dall’analisi è risultato che la risposta IgG1 e
IgG4 decresce con l’età in tutte le inchieste e per entrambe le etnie (Fig. 4.25). In
particolare, la diminuzione in funzione dell’età dei livelli di IgG1 e di IgG4 risulta
statisticamente significativa ad Agosto 1994 sia per i Mossi che per i Fulani (Mossi: IgG1
(p=0,038), IgG4 (p=0,002); Fulani: IgG1 (p=0,011), IgG4 (p=0,02); Kruskal-Wallis test).
74

Figura 4.25 Stratificazione dei livelli di IgG1 e IgG4 in funzione
dell’età, della stagione e del gruppo etnico (M=Mossi;
F=Fulani; box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea: mediana;
punti:outlier; i valori di p sono stati calcolati mediante il test di
Kruskal-Wallis).
Il trend è simile nelle altre inchieste anche se non raggiunge la significatività statistica,
probabilmente anche a causa della numerosità del campione. Da quest’analisi emerge
75

anche una diversa distribuzione e cinetica di produzione delle due sottoclassi nei diversi
gruppi di età, in particolare nei primi anni di vita. Per osservare questo fenomeno in modo
più dettagliato si è proceduto a scomporre ulteriormente i gruppi di età in classi così
rappresentate: 1-3 anni, 3-5 anni, 5-7 anni, 7-11 anni, 11-16 anni, 16-21 anni, 21-30 anni e
>30 anni. Questa suddivisione non consente di avere un corretto supporto statistico per via
della bassa numerosità di alcuni gruppi di età, ma risulta ugualmente utile in quanto
permette di osservare l’andamento nei primi anni di vita degli individui. Nella Fig. 4.26, è
stata mostrata la percentuale di contributo di ciascuna sottoclasse alla risposta totale
osservata. È stato riportato solo l’andamento osservato per i due gruppi etnici nell’inchiesta
di Agosto 1994 in quanto rappresentativa di un andamento comune. Da questo tipo di
rappresentazione emerge che la percentuale di contributo della risposta IgG1 raggiunge,
per entrambi i gruppi etnici, il livello più alto solo nei primissimi anni di vita (1-3 anni)
successivamente il contributo maggiore è dato dalla risposta IgG4 con percentuali che
oscillano tra il 75- 50% per i Mossi e il 75- 60% per i Fulani.
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Mossi
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30
IgG4
IgG1
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Fulani
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30
Figura 4.26 Contributo percentuale di ciascuna sottoclasse
IgG alla risposta totale osservata ad Agosto 1994.
Invece, nella Fig. 4.27 è stato riportato il confronto inter-etnico della risposta IgG1 e IgG4
in funzione delle classi di età adoperate nell’analisi precedente. Dalla figura appare
evidente come nei due gruppi etnici lo sviluppo della risposta IgG1 e IgG4 avvenga in
tempi diversi. Infatti le IgG1 raggiungono nei Fulani il picco più alto nella fascia di età 1-3
anni mentre nei Mossi avviene successivamente, intorno ai 3-5 anni di età. In entrambe le
etnie, poi, il livello diminuisce e rimane a livelli più bassi dall’età di 11 anni in poi. Le
IgG4, invece, nei Mossi sono presenti a livelli molto bassi nei primi anni di vita e
incominciano a crescere dopo i 3 anni per raggiungere il picco massimo nella fascia di età
5-7 anni. Nei Fulani la cinetica è leggermente diversa con i livelli di IgG4 già elevati a 1-3
IgG4
IgG1
76

anni con un picco intorno ai 5 anni. Successivamente questa sottoclasse diventa
predominante negli anni successivi per entrambe le etnie. Ciò fa supporre che lo switch
isotipico da IgG1 a IgG4, e quindi il fenomeno della tolleranza, avvenga precocemente nel
gruppo etnico dei Fulani (prima dei 5 anni di età) mentre nei Mossi si presenterebbe più
tardi (dopo i 5 anni di età).
OD
OD
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Agosto '94: IgG1
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30
Agosto '94 IgG4
1-3 3-5 5-7 7-11 11-16 16-21 21-30 >30
Mossi
Fulani
Mossi
Fulani
Figura 4.27 Confronto inter-etnico della riposta IgG1 e IgG4
anti gSG6 stratificata per gruppi di età (Agosto 1994)(i punti
rappresentano la media aritmetica).
La differente cinetica di risposta delle IgG1 e delle IgG4 in funzione dell’età, sebbene non
sia ancora stata verificata in lavori su culicidi, è in accordo con quanto visto nelle risposte
anticorpali ad alcuni alimenti. In particolare, il rapporto IgG4/IgG1è minore nei bambini di
1-3 anni e aumenta nell’adolescenza. Questo slittamento della risposta a favore delle IgG4
è stato correlato con una stimolazione cronica dell’antigene, in cui questa sottoclasse si
sostituisce alle IgG1 nella risposta anticorpale (Calkhoven et al.,1991). Inoltre, i bassi
livelli di espressione di IgG4 nei primissimi anni di vita potrebbero dipendere dalla
mancanza di cellule accessorie mature (come macrofagi e cellule dendritiche) che
77

successivamente stimoleranno la produzione di IgG4 mediante il rilascio di IL-10
(Punnonen et al., 1993).
4.5 Analisi comparativa della risposta IgG alla proteina salivare gSG6 di Anopheles
funestus e di Anopheles gambiae
Come descritto nel paragrafo 1.7.3, la proteina gSG6 di An. gambiae presenta una identità
di sequenza con An. arabiensis e An. funestus rispettivamente del 99% e del 81%. Quindi,
mentre per An. arabiensis la cross-reattività può essere data per scontata, per verificare la
possibilità di una sovrapposizione nella risposta ai due antigeni di An. gambiae e An.
funestus abbiamo effettuato un’analisi comparativa con le due proteine. La cross reattività
tra queste proteine fornirebbe l’opportunità di utilizzare un solo marcatore sierologico per
valutare contemporaneamente l’esposizione a punture dei tre principali vettori di malaria
africani. Inoltre, dal momento che le densità di An. funestus abbondano tra la fine della
stagione delle piogge e l’inizio della stagione secca, sostituendo quindi An. gambiae nelle
densità relative (Ilboudo-Sanogo et al., 2010), l’uso di un marcatore comune potrebbe
rivelarsi utile al fine valutare il rischio durante tutto il periodo di alta trasmissione.
4.5.1 Espressione e purificazione di gSG6 di Anopheles funestus
La proteina salivare gSG6 di Anopheles funestus è stata espressa in forma ricombinante e
purificata dal Dott. R. Ronca (Università Federico II, Napoli) in maniera del tutto simile a
quanto fatto in precedenza per la proteina omologa di An. gambiae. In Fig. 4.28 è mostrata
la banda di circa 13kDa corrispondente alla proteina di interesse dopo induzione con IPTG.
78

10 kDa
UN MW IN
Figura 4.28 Analisi dell’espressione di gSG6 An. funestus in
E.coli (Un=campione non indotto; Ind= campione indotto;
MW= marcatore di peso molecolare)
Anche in questo caso è stato necessario solubilizzare la proteina dai corpi di inclusione per
poi procedere a cromatografia d’affinità in condizioni denaturanti (Fig. 4.29).
MW AC
Figura 4.29 Analisi della frazione di gSG6 An. funestus
ottenuta dopo cromatografia d'affinità (AC= frazione di
eluato; MW= marcatore di peso molecolare).
Infine, le frazioni purificate sono state rinaturate e ulteriormente purificate mediante
cromatografia a scambio anionico (Fig. 4.30).
79

MW IEC
Figura 4.30 Analisi della frazione di gSG6 ottenuta dopo
cromatografia a scambio anionico (IEC= frazione di eluato;
MW marcatore di peso molecolare).
4.5.2 Immunogenicità di gSG6 di An.funestus
L’analisi della risposta anticorpale IgG specifica alla proteina gSG6 di Anopheles funestus
è stata effettuata su un sottocampione del Burkina Faso di 335 individui appartenente
all’etnia dei Mossi. I sieri analizzati fanno parte del periodo di trasmissione che
comprende: agosto 1994, ottobre 1994 e marzo 1995. La risposta anticorpale è stata
confrontata con quella ottenuta sugli stessi individui usando come antigene: gSG6 di An.
gambiae ed una combinazione di gSG6 di An. gambiae e di An. funestus insieme in uguale
concentrazione. Nella successiva trattazione dell’analisi, per facilitare la lettura, mi riferirò
a questi antigeni come gSG6 ga (in riferimento a gSG6 di An. gambiae), gSG6 fu (in
riferimento a gSG6 di An. funestus) e gSG6 ga&fu (in riferimento a gSG6 di An. gambiae e
di An. funestus).
L’immunogenicità di gSG6 fu è stata innanzitutto confermata confrontando la risposta
anticorpale in individui esposti e in un sottogruppo di 48 individui di controllo. L’analisi
conferma che gSG6 fu è immunogenica e non si ha cross-reazione con altre proteine in
individui non esposti. La differenza risulta statisticamente significativa per tutte le
inchieste (p

OD
OD
OD
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Agosto 1994
esposti controlli
Ottobre 1994
esposti controlli
Marzo 1995
esposti controlli
Median
25%-75%
5%-95%
Median
25%-75%
5%-95%
Median
25%-75%
5%-95%
Figura 4.31 Analisi delle risposta anticorpale a gSG6 di An.
funestus in individui esposti e controlli nelle tre inchieste
(Agosto 1994: esposti (57), controlli (47); Ottobre 1994:
esposti (56), controlli (47); esposti (34), controlli (47)).
81

4.5.3 Variabilità stagionale della risposta a gSG6 di An.funestus
Come atteso sulla base delle analisi precedenti anche la risposta anticorpale a gSG6 fu
mostra un andamento stagionale che è in accordo con il periodo di trasmissione
(p=0,0015). In particolare, come mostrato in Fig. 4.32, i livelli anticorpali fra i responders
aumentano significativamente durante la stagione delle piogge/alta trasmissione, da Agosto
1994 a Ottobre 1994 (p

Figura 4.33 Confronto stagionale della risposta anticorpale ai
tre marcatori salivari (box: 25%-75%; wiskers: 5%-95%; linea:
mediana)
Figura 4.34 Confronto stagionale delle prevalenze ai tre
marcatori salivari (wiskers: intervallo di confidenza al 95%).
Nonostante nella zona di studio An. funestus non rappresenti mai più del 20%, quest’analisi
dimostra abbastanza chiaramente la cross reattività tra i due marcatori. La possibilità di
sfruttare la risposta IgG anti-gSG6 di An. gambiae come marcatore di esposizione a tutti e
tre i principali vettori di malaria in Africa è particolarmente vantaggiosa consentendo
valutazioni attendibili su un vasto territorio come quello africano.
83

4.6 Analisi della risposta anticorpale alla proteina salivare: anofelina
Come riportato nell’introduzione l’anofelina è un polipeptide ad azione antitrombinica
caratteristico di zanzare del genere Anoheles. La proteina è stata espressa in forma
ricombinate nel laboratorio del Dott. B. Arcà presso l’Università federico II di Napoli dove
è attualmente in corso di caratterizzazione funzionale. La descrizione della procedura di
espressione e purificazione esula gli scopi di questa tesi e sarà oggetto di uno specifico
manoscritto (R. Ronca, in preparazione). Ai fini del lavoro riportato in questa tesi mi
limiterò a citare che la proteina è stata espressa in forma ricombinante in E. coli e
purificata all’omogeneità come anche confermato da analisi di spettrometria di massa. Mi
limiterò quindi, qui di seguito, a riportare alcuni dati preliminari che indicano
nell’anofelina di An. gambiae un ulteriore potenziale marcatore di esposizione a punture di
Anopheles.
4.6.2 Immunogenicità dell’anofelina
L’analisi della risposta IgG specifica all’anofelina di An. gambiae è stata effettuata su un
sottocampione di circa 30 individui del Burkina Faso campionati nell’inchiesta di Agosto
1995, appartenenti ad entrambe le etnie Fulani e Mossi, e su un sottocampione di controllo
costituito da 30 individui di origine europea. Questa risposta anticorpale è stata inoltre
confrontata nello stesso esperimento e sugli stessi individui con la risposta anticorpale anti-
gSG6 di An. gambiae. Analizzando i livelli anticorpali anti-anofelina negli individui
esposti a punture anofeliche e in quelli di controllo si osserva una risposta
significativamente maggiore (p

OD
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Esposti (20) Controlli (25)
Mean
Mean±SE
Mean±0.95 Conf. Interval
Figura 4.35 Risposta anticorpale all’anofelina in individui
esposti e di controllo (in parentesi è indicata la numerosità del
campione).
4.6.3 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina e a gSG6 di An. gambiae
La risposta IgG anti-anofelina è stata confrontata con la risposta IgG anti-gSG6 degli
individui considerati responders per entrambe le proteine. Dall’analisi è emerso che la
risposta anticorpale all’anofelina è significativamente maggiore rispetto a quella osservata
per gSG6 (p=0,02) (Fig. 4.36).
OD
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Anophelina (17) gSG6 (17)
Median
25%-75%
5%-95%
Figura 4.36 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina
e a gSG6 (in parentesi il numero di responders ad entrambe le
proteine)
85

Dal momento che il campione così analizzato comprende al suo interno individui di
entrambe le etnie, si è proceduto a confrontare la risposta anticorpale alle due proteine
salivari stratificando il campione per gruppo etnico al fine di mettere in evidenza potenziali
differenze nella risposta inter-etnica. Come mostrato in Fig. 4.37, sia nei Mossi che nei
Fulani i livelli anticorpali anti-anofelina sono più elevati rispetto a quelli per gSG6. Questa
differenza non è supportata da una significatività statistica, a causa della scarsa numerosità
del campione, quindi si può concludere che l’anofelina possiede una immunogenicità circa
paragonabile a quella di gSG6.
OD
OD MEDIA an
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Mossi
Anophelina (6) gSG6 (6)
Fulani
Anophelina (11) gSG6 (11)
Median
25%-75%
5%-95%
Median
25%-75%
5%-95%
Figura 4.37 Confronto della risposta anticorpale all’anofelina
e a gSG6 nei due gruppi etnici, Mossi e Fulani (in parentesi il
numero di responders ad entrambe le proteine).
86

Inoltre, dalla Fig. 4.37 si deduce anche una variabilità inter-etnica nella risposta
all’anofelina. Stratificando il campione per gruppo etnico e confrontato la risposta
anticorpale specifica nei due gruppi si osserva come anche per quanto riguarda l’anofelina,
al pari di gSG6, i Fulani mostrano una risposta anticorpale più elevata rispetto ai Mossi
(Fig. 4.38).
OD
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
Anofelina
Fulani (12) Mossi (8)
Mean
Mean±SE
Mean±0.95 Conf. Interval
Figura 4.38 Confronto inter-etnico della risposta anticorpale
all’anofelina (in parentesi il numero di responders ad
entrambe le proteine).
4.6.4 Differenze di sensibilità tra anofelina e gSG6
Confrontando per ciascun individuo testato il valore della risposta anticorpale a ciascuna
proteina si rileva una eterogeneità che è comune ad entrambi gli antigeni (Fig. 4.39). Infatti
ci sono individui la cui risposta IgG anti- gSG6 risulta maggiore rispetto a quella anti-
anofelina e viceversa oppure risposte molto simili tra di loro.
87

OD
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Variabilità individuale
Individui
gSG6
Anofelina
Figura 4.39 Variabilità individuale della risposta anticorpale
all’anofelina e a gSG6.
Se consideriamo la soglia di positività per entrambe le proteine (gSG6=0,39 OD;
anofelina=0,48 OD), la prevalenza dei responders è pari al 96% (24 individui su 25; limiti
fiduciali al 95%= 80,5%-99,3%) per gSG6 e al 72% (18 individui su 25; limiti fiduciali al
95%= 52,4%-85,7%) per l’anofelina (Fig. 4.40).
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Prevalenze di individui responders
gSG6 Anofelina
Figura 4.40 Prevalenze dei responders all’anofelina e a gSG6
(gSG6 n=24; anofelina=18; individui tot:25)
Quindi, l’analisi preliminare della risposta anticorpale specifica all’anofelina fornisce
evidenti indicazioni sull’immunogenicità di questa proteina, che sembra rappresentare
un’addizionale utile marcatore epidemiologico di esposizione a punture anofeliche.
Ulteriori studi, estesi ad un campione più rappresentativo, sono certamenti necessari per
confermare le differenze qui osservate. Ad ogni modo, è verosimile che l’utilizzo
88

combinato di gSG6 e anofelina, possa consentire di ottenere una maggiore sensibilità nella
diagnosi sierologica che potrebbe essere particolarmente utile per analisi epidemiologiche
in zone a bassa esposizione/trasmissione.
89

5 Conclusioni
I risultati riportati in questa tesi dimostrano per la prima volta, in uno studio su
larga scala, che singole proteine salivari di Anopheles possono essere impiegate per
misurare la risposta anticorpale specifica contro antigeni salivari nell’ospite umano. In
particolare, la proteina gSG6 si è dimostrata essere un sensibile marcatore di esposizione a
punture di specie vettrici di malaria in Africa (An. gambiae s.l. ed An. funestus), aprendo
nuovi scenari per lo sviluppo di protocolli di valutazione del rischio di esposizione e di
verifica degli interventi di controllo. Infatti, la determinazione del rischio di trasmissione e
di esposizione ai vettori malarici, attualmente effettuata mediante metodi entomologici e di
diagnosi parassitologica, rappresenta un aspetto fondamentale nell’organizzazione e nella
valutazione dell’efficienza di un programma di controllo. Tuttavia, questi metodi risultano
scarsamente sensibili in situazioni di basse densità anofeliche e richiedono competenze e
risorse non sempre disponibili. I risultati qui riportati indicano la possibilità di impiegare la
risposta anticorpale anti-gSG6 come metodo affidabile ed in grado di complementare
efficacemente le misure entomologiche classiche. Una metodologia di questo tipo, inoltre,
ha il vantaggio di permettere una valutazione del reale contatto uomo-anofele, cioè
dell’esposizione “effettiva” a punture anofeliche.
Innanzitutto la risposta umorale umana alla proteina salivare gSG6 è risultata
direttamente correlata alla STAGIONALITÀ. Infatti, abbiamo visto che il titolo anticorpale
aumenta durante la stagione delle piogge, quando le densità anofeliche e l’intensità della
trasmissione malarica sono ai massimi livelli. Invece, durante la stagione secca, con basse
densità anofeliche e bassa trasmissione, si assiste a una caduta significativa del titolo
anticorpale evidenziando una DINAMICA A BREVE TERMINE della risposta. Queste sono
caratteristiche di base e di fondamentale importanza che un buon marcatore sierologico
deve possedere. Inoltre, il titolo anticorpale ha mostrato una DIPENDENZA DALL’ETÀ con
un andamento che è risultato opposto rispetto a quello noto per gli antigeni malarici. In
particolare, la risposta ha inizio precocemente, raggiunge il picco intorno ai 2 anni di età e
permane a livelli elevati fino a circa 10 anni, per poi diminuire progressivamente. È
verosimile che tale andamento sia dovuto all’instaurarsi nell’ospite di fenomeni di
tolleranza immunologica causati dalle lunghe e ripetute esposizioni agli antigeni salivari.
Sebbene i sottostanti meccanismi non siano ancora ben chiariti, numerosi dati riportati in
letteratura sostengono questa ipotesi, che trova ulteriore conferma nei risultati forniti
dall’analisi delle sottoclassi IgG1 ed IgG4. Infatti gli elevati livelli di IgG4 anti-gSG6
nonché lo switch IgG1/IgG4 che avviene precocemente (intorno ai 5 anni di età) sono
90

completamente in accordo con l’ipotizzata tolleranza. I nostri dati, inoltre, sottolineano
come il BACKGROUND GENETICO, laddove possibile, vada tenuto nella debita
considerazione. Infatti, stratificando il campione secondo i due differenti gruppi etnici
presenti nel nostro campione, Fulani e Mossi, si osserva una risposta IgG anti-gSG6
costantemente più alta nei primi rispetto ai secondi. Questo dato è in linea con quanto in
precedenza riportato in letteratura riguardo ai Fulani, che mostrano una più elevata risposta
anticorpale ad antigeni malarici ed una minore suscettibilità alla malaria. Quindi la nostra
analisi, nel suo complesso, fornisce una serie di informazioni essenziali per la messa a
punto di protocolli da applicare a popolazioni eterogenee e con forti stagionalità nei livelli
di trasmissione della malattia.
Abbiamo sottolineato che la proteina gSG6 è Anopheles-specifica ed è assente in
altri culicidi e altri artropodi ematofagi, ed abbiamo effettuato il nostro studio su larga
scala impiegando la proteina gSG6 di An. gambiae. Dal momento che An. gambiae s.s. è
certamente il principale, ma non l’unico, vettore africano di malaria è ovvio chiedersi quale
sia il grado di cross-reattività con omologhi da altri importanti vettori. A questo proposito
possiamo individuare in An. gambiae s.s., An. arabiensis ed An. funestus i tre principali
vettori africani, responsabili di oltre il 90% della trasmisione nell’area sub-Sahariana. Per
quanto riguarda An. arabiensis, un membro del complesso di An. gambiae, la cross-
reattività può essere data per scontata dal momento che i due omologhi mostrano il 99% di
identità. Le proteine gSG6 di An. gambiae e di An. funestus presentano invece un’identità
di sequenza del 81%, lasciando aperto l’interrogativo sul grado di cross-reattività. L’analisi
comparativa con le proteine di An. gambiae e di An. funestus indica chiaramente una larga
sovrapposizione nella risposta ai due antigeni, suggerendo che la proteina gSG6 può essere
utilizzata come MARCATORE DI ESPOSIZIONE AI TRE I PRINCIPALI VETTORI DI MALARIA
AFRICANI. Il dato di cross-reattività tra le proteine gSG6 di An. gambiae e di An. funestus
rende verosimile ipotizzare uno scenario simile anche con An. stephensi (importante
vettore asiatico di malaria), con cui gSG6 di An. gambiae condivide l’81% dei residui
aminoacidici. Se quest’ipotesi fosse confermata, si potrebbero ottenere con un unico
marcatore informazioni atte alla valutazione del rischio di trasmissione su più contesti
epidemiologici e geografici.
È importante evidenziare che i risultati ottenuti si riferiscono ad una sola area
geografica e ad una situazione epidemiologica caratterizzata da elevati livelli di
trasmissione malarica e che, quindi, i dati qui riportati andranno estesi al livello
macrogeografico e validati in condizioni di bassi livelli di trasmissione. In ogni caso,
91

questo lavoro di tesi rappresenta un’importante prova di principio circa l’applicabilità di un
metodo di valutazione dell’esposizione a punture di zanzare mediante l’impiego di antigeni
salivari ricombinanti. Questo scenario è certamente di grande interesse ed implica
ripercussioni che vanno oltre l’epidemiologia della malaria e che potrebbero trovare
interessanti applicazioni ad altre malattie a trasmissione vettoriale.
92

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