Endocrinologie Metabolisme en Diversen - NVKC

) mathematische evaluatie:
• competatief: de hoeveelheid gebonden gelabeld antigeen is omgekeerd evenredig aan de
antigeenconcentratie.
• niet-competatief: de hoeveelheid gebonden antigeen levert een directe maat voor de
antigeenconcentratie.
c) detectietechnieken:
• radioimmunoassays (e.g. RIA v.s. IRMA)
• enzyme immunoassays (e.g. EIA v.s. IEMA)
• fluoroimmunoassays (e.g. FEIA v.s. IFMA, FIEMA)
• chemiluminescent immunoassays (e.g. LIA v.s. ILMA, LEIA, LIEMA)
d) storingen bij de analyse;
• interferentie met het antigeen:
binding van het antigeen aan eiwitten zoals SHBG kan de concentratie van het (gelabeld)
antigeen beïnvloeden. Ook kan de conformatie van het antigeen veranderen door de aan- of
afwezigheid van Mg- en/of Ca-ionen (EDTA-effect)
• interferentie met het antilichaam:
high-dose hook effect: bij hoge concentraties antigeen zijn zowel het capture-antibody als
het detecting-antibody verzadigd met antigeen. De gemeten antigeenconcentratie valt veel
lager uit dan de daadwerkelijk antigeenconcentratie. Speelt mn. bij die assays met een
relatief lage antilichaamcoating en bij assays waarbij de mogelijke antigeenconcentratie
een grote bandbreedte heeft (e.g. tumormarkers). Remedie: verdunning van het humaan
serum
low-dose hook effect: bij lage concentraties van het antigeen wordt meer gelabeld
antigeen worden gebonden dan bij afwezigheid van (ongelabeld) antigeen.
Heterofiele antilichamen (human anti-mouse antibodies; HAMA’s): complexvorming in
een sandwich-assay door aanwezigheid van antilichamen die met zowel met de “capture-”
als met de “deteceting antibodies” reageren. Remedie: toevoegen van muis-antilichamen
aan humaan serum.
e) stabiliteit peptidehomonen: ofschoon de concentratie van (poly-)peptide hormonen veelal erg laag
is (nanogr/ml of picogr/ml) kunnen de meeste (poly-)peptidehormonen zonder problemen in bloed
of urine bepaald worden. Extractie- of concentratiestappen zijn pas noodzakelijk wanneer de
sensitiviteit van de assay te laag is of wanneer de concentratie van bepaalde plasmaproteases
voldoende hoog is om in vitro een betreffend hormoon te inactiveren (mn. ACTH). Voor de
meeste (poly-)peptidehormonen geldt echter dat het vaak voldoende is het bloed- of urinemonster
bij 4 o C weg te zetten. Eventueel kunnen proteolyse-inhibitors (eg. apoprotinine) worden
toegevoegd om enzymdegradatie te voorkomen. Voor ACTH-, ADH- of oxytocine-bepalingen
dient het bloed direct op ijs te worden afgenomen in vooraf gekoelde EDTA-afnamebuizen (van
polystyreen, indien het een ACTH-bepaling betreft).
- isolatie en zuivering van hormonen en metabolieten, bepaling hormonen en afbraakproducten m.b.v.
chromatografische technieken
a) isolatie en zuivering van hormonen en metabolieten
• eiwit en (poly-)peptidehormonen: doorgaans géén voorafgaande isolatie- of zuiveringstappen
nodig (zie ook: stabiliteit peptidehormoon).
• steroïdhormonen: doorgaans géén voorafgaande isolatie of zuiveringsstappen nodig voor de
bepaling van steroïdhormonen m.b.v. immunoassays of HPLC-methoden.
Steroïdhormonen zijn aanwezig in bloed en –in geconjugeerde en ongeconjugeerde vorm- in
urine. Voor de bepaling van de totale concentratie van een steroïdhormoon in urine, dienen de
ether- en estherverbindingen van het geconjugeerde steroïdhormoon te worden verbroken
d.m.v. hydrolyse. Van de twee gebruikelijke methoden (i.e. zuur of enzymatisch) heeft de zure
hydrolyse de voorkeur. Hormoon-extractie d.m.v. organische oplosmiddelen is afhankelijk
van het aantal hydrofiele groepen (i.e. androgenen en oestrogenen in benzeen of diethyl-ether;
corticosteroïden in chloroform of ethyl-acetaat). Voor de analyse van de totale concentratie
van een steroïdhormoon in bloed is voorafgaande hydrolyse niet nodig, omdat de eiwitgebonden
steroïdhormonen door de organische oplosmiddelen vrijkomen. Verdere zuivering
van het steroïdhormoon van contaminanten is mogelijk met alkalische oplossingen (NaOH, of
natrium(bi-)carbonaat), gevolgd door het opnieuw uitschudden m.b.v. organische
oplosmiddelen.
10