E-Paper - GIT Verlag
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Titelbeitrag<br />
Probenbezeichnung<br />
Fluoreszenzfarbstoff<br />
Schwellenwert<br />
[RFE]<br />
Ct-<br />
Wert<br />
Abb. 1: Amplifikationskurven der Mycoplasma fermentans-Proben mit bzw. ohne vorherigen<br />
Vivaspin-Konzentrierungsschritt inkl. Coating Buffer<br />
Negativkontrolle<br />
Ohne<br />
Konzentrierungsschritt<br />
Aufkonzentrierung<br />
mit<br />
Vivaspin 20<br />
(inkl. Coating<br />
Buffer)<br />
FAM 2000 No Ct<br />
FAM 2000 No Ct<br />
FAM 2000 No Ct<br />
FAM 2000 24,60<br />
FAM 2000 24,87<br />
FAM 2000 17,16<br />
FAM 2000 17,02<br />
FAM 2000 16,72<br />
FAM 2000 17,18<br />
FAM 2000 16,91<br />
FAM 2000 16,25<br />
FAM 2000 16,91<br />
FAM 2000 16,25<br />
vervollständigen. Anschließend wurden die<br />
Proben einer DNA-Isolierung unter Verwendung<br />
von Silica-basierten Zentrifugenröhrchen<br />
unterzogen. Im Rahmen der DNA-Isolierung<br />
kam das Kit Microsart AMP Extraction gemäß<br />
Kit-Handbuch zum Einsatz. Die so gewonnene<br />
DNA wurde anschließend nahezu vollständig in<br />
die Echtzeit PCR (50 µl des 60 µl DNA-Eluats)<br />
eingesetzt, um ein Maximum an Sensitivität zu<br />
erreichen.<br />
Parallel wurde die DNA desselben Ausgangsmaterials<br />
ohne Konzentrierungsschritt isoliert, um<br />
später einen direkten Vergleich zwischen Proben<br />
mit und ohne Aufkonzentrierung zu ermöglichen.<br />
Die PCR-Reaktionen wurden laut Kit-Handbuch<br />
nach folgendem Protokoll angesetzt:<br />
▪▪<br />
Zentrifugation der im Kit enthaltenen Reak<br />
tionsgefäße mit den lyophilisierten Komponenten<br />
für 5 Sekunden bei max. Geschwindigkeit<br />
▪▪<br />
Zugabe von 1275 µl Rehydratisierungspuffer<br />
zu dem Primer/Sonden/Nukleotid-Mix (roter<br />
Deckel)<br />
▪▪<br />
Zugabe von jeweils 300 µl Wasser (PCR-Qualität)<br />
zur Positivkontrolle (grüner Deckel) und<br />
zur Internen Kontrolle (gelber Deckel)<br />
▪▪<br />
Fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur<br />
zur vollständigen Rehydratisierung<br />
▪▪<br />
Rehydratisierte Lösungen kurz mit Vortex-<br />
Mixer mischen und herunterzentrifugieren<br />
▪▪<br />
Zusammensetzung des Mastermix: Pro Reaktion<br />
49 µl Primer/Sonden/Nukleotid-Mix (roter<br />
Deckel) und 1 µl der Internen Kontrolle (gelber<br />
Deckel) in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettieren<br />
und mischen<br />
▪▪<br />
Jeweils 50 µl des Mastermix plus 50 µl Probe<br />
oder Positiv- oder Negativ-Kontrollmaterial<br />
(z. B. Elutionspuffer, PCR-Wasser oder 10 mM<br />
Tris-Puffer) in 200 µl PCR-Gefäße pipettieren<br />
und in den vorprogrammierten Realtime<br />
Thermoycler stellen<br />
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 2 sowie in<br />
Abbildung 1 dargestellt. Verglichen wurden stets<br />
die Ct-Werte (Cycle Threshold) der aufkonzentrierten<br />
Proben mit den Proben, die keinen Konzentrierungsschritt<br />
erfahren hatten. Der Ct-Wert ist<br />
der Amplifikationszyklus, bei dem ein bestimmter<br />
Fluoreszenz-Schwellenwert überschritten wird.<br />
In Tabelle 1 sind die Einzel-Ct-Werte aufgelistet<br />
und Tabelle 2 zeigt einerseits den sich aus Tab. 1<br />
ergebenden, gemittelten Delta-Ct-Wert und anderseits<br />
die Ct-Differenz, die sich mit bzw. ohne<br />
die Verwendung des Coating Buffers ergibt. Der<br />
Delta-Ct-Wert wird wie folgt ermittelt:<br />
Δ Ct = Ct (Probe ohne Vivaspin Aufkonzentrierung)<br />
– Ct (Aufkonzentrierte Probe)<br />
Durch Konzentrierung in Kombination mit<br />
dem Coating Buffer konnte ein Delta-Ct-Wert<br />
von Δ Ct > 7 für Mycoplasma fermentans erreicht<br />
werden. Wurde auf den Coating Buffer<br />
verzichtet (Einzelwerte nicht aufgeführt),<br />
konnte man zwar von kürzeren Zentrifugationszeiten<br />
der Vivaspin-Einheiten profitieren, jedoch<br />
wurde hierfür ein geringerer Delta-Ct-Wert von<br />
Δ Ct ~ 6 ermittelt, der aber dennoch eine deutliche<br />
Sensitivitätssteigerung bedeutet.<br />
Für die Überprüfung von Mykoplasmen-<br />
Kontaminationen sind Parameter wie Sensitivität<br />
und Zeitersparnis essentiell. Diese Anforderungen<br />
werden mit dem vorgestellten PCR-Kit<br />
in Verbindung mit dem Konzentrierungsschritt<br />
Mehr Informationen<br />
zum Thema:<br />
http://bit.ly/<strong>GIT</strong>-PCR<br />
Vivaspin<br />
20<br />
(VS20)<br />
Kontakt |<br />
Stephanie Schweizer<br />
Alxeandra Scholz<br />
Dominic Grone<br />
Sartorius AG<br />
Tel.: 0551/308-0<br />
info@sartorius.com<br />
www.sartorius.com<br />
Membran<br />
Behandlung<br />
VS20 + 18 ml<br />
Probe → 10 min<br />
3.500 x g<br />
VS20 + 18 ml<br />
Probe + 2 ml<br />
Coating Buffer →<br />
20 min 3.500 x g<br />
Zur Bestellung:<br />
http://bit.ly/Sartorius-<br />
MycoplasmaDetectionKits<br />
Tab. 1: Ct-Werte der Proben mit bzw. ohne<br />
Konzentrierungsschritt; RFE = Relative Fluoreszenzeinheiten<br />
Probenvolumen<br />
Δ Ct<br />
18 ml 6,07<br />
18 ml 7,90<br />
Tab. 2: Δ Ct - Werte mit und ohne Einsatz von<br />
Coating Buffer<br />
erfüllt. Durch den Einsatz der Vivaspin 20<br />
konnte eine Ct-Verbesserung von Δ Ct > 7 erreicht<br />
werden, was einer Erhöhung der Sensitivität<br />
um etwa 2 Log-Stufen entspricht. Dies<br />
macht den Microsart AMP Mycoplasma Detection<br />
Kit und die Vivaspin 20 Einheit zu einem<br />
kosteneffizienten und praktischen Schnelltest<br />
für Mykoplasmen.<br />
<strong>GIT</strong> Labor-Fachzeitschrift 9/2013 ▪▪▪ 549
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