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Fachartikel Untersuchung der chemischen Umgebung während der Katalyse. Dies kann man erreichen, indem man eine isotopenmarkierte natürliche Aminosäure mit einer Schutzgruppe einbringt und diese anschließend entfernt oder direkt eine modifizierte isotopenmarkierte nnAS einbaut. Auch das NMR aktive 19 F konnte schon erfolgreich in Form von fluorierten Derivaten der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Lysin mit dem Stopp-Codon-Suppressionssystem eingebaut werden. Abb. 2: Oben: Modifikationsschema. Die nnAS mit bioorthogonaler Funktion wird über die Erweiterung des genetischen Codes in ein Protein eingebaut und anschließend z. B. mit einem Fluorophor markiert. Diese Reaktionen können unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und ermöglichen auch Anwendungen in vivo. Unten: Beispiele für nnAS. Weitere Spektroskopiemethoden Unter den nnAS befinden sich auch einige mit guten Infrarotabsorptionseigenschaften, wie das p-Azidophenylalanin (AzF). Die Azidogruppe mit seiner asymmetrischen Streckschwingung konnte bereits benutzt werden, um schnelle Konformationswechsel in Rhodopsin zu verfolgen. Die Fluoreszenzspektroskopie erlaubt die Untersuchung der Dynamik von Proteinen mit sehr hoher Auflösung und Sensitivität bis hin zur Einzelmolekülspektroskopie. Dazu müssen diese mit einem Farbstoff modifiziert werden. Hier eignen sich nnAS mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen, die sich z. B. in einer 3+2 Zykloaddition („Klickreaktion“) modifizieren lassen. Diese verbindet klassischerweise ein Alkin mit einem Azid, wobei ein zelltoxischer Cu(I) Katalysator benötigt wird, der die Reaktion auf in vitro Anwendungen beschränkt. Weiterentwicklungen, die sich stark gespannter Ringsysteme bedienen, können auf den Katalysator vollständig verzichten und ermöglichen so auch den Einsatz in vivo. Der Energietransfer zwischen zwei Farbstoffen (FRET) mit geeigneten spektralen Eigenschaften wird eingesetzt, um Faltung oder Konformationsänderungen von Proteinen zu beobachten. Hierbei nutzt man die Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der Distanz zwischen einem Donor und einem Akzeptor-Fluorophor. Um ein Protein mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren zu versehen, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Ein Farbstoff kann über eine fluoreszierende nnAS oder eine andere nichtnatürliche Funktion, die dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff verknüpft wird, eingebracht werden. Der Andere kann über natürliche Cysteine, die gut und effektiv mit Maleimiden reagieren, konjugiert werden, wobei diese Methode auf cysteinfreie Proteine beschränkt ist. Alternativ kann der zweite Farbstoff über die Affinität zu einer definierten Peptidsequenz, z. B. Flash-Tag, oder in Form eines fluoreszenten Proteins angebracht werden. Chakraborty et al. benutzten den separaten Einbau von AzF in zwei Untereinheiten der RNA-Polymerase-Klammer und konnten so die beiden Untereinheiten mit Hilfe der Staudinger-Ligation mit unterschiedlichen Fluorophoren markieren. Nach der Rückfaltung der Einheiten konnte dann das Öffnen und Schließen der Klammer über Einzelmolekül-FRET verfolgt werden [3]. Orthogonale Ribosomen Für den Einbau von zwei oder mehr unterschiedlichen nnAS in ein Protein bedarf es weiterer Modifizierungen des vorhandenen Systems. Um der Limitierung durch Stopp- Codons zu entgehen, werden nicht codierende, so genannte blank codons benötigt. Die Erweiterung des genetischen Codes von Triplet- auf Quadruplet-Codons würde theoretisch 256 blank codons bieten, die für den Einbau ebenso vieler neuer Verbindungen genutzt werden könnten. Allerdings werden pro weiterem Codon auch neue Synthetase/ tRNA Paare benötigt, die orthogonal zu den bereits in der Wirtszelle vorhanden Paaren sein müssen und den Einbau der jeweiligen nnAS bewirken. Nicht zuletzt muss das Ribosom so modifiziert werden, dass es mit den Komponenten eine effiziente Synthese durchführen kann. Außerdem dürfen all diese Veränderungen nicht mit der Synthese der zelleigenen Proteine interferieren, was andernfalls zum Tod der Zelle führen würde. Durch die Entwicklung eines parallelen Translationsapparates schufen Chin und seine Mitarbeiter eine Art Arbeitskopie des Ribosoms, das dadurch von den Zwängen der Proteinsynthese befreit, hin zu neuen Eigenschaften evolviert werden konnte. Sie erreichten dies durch Mutation der Shine-Dalgarno-Sequenz auf der mRNA und der entsprechenden komplementären Sequenz in der 16S rRNA der kleinen Untereinheit des Ribosoms. Dadurch entstanden mehrere orthogonale Ribosom/mRNA Paare, die parallel, aber unabhängig zu ihren unveränderten Vorgängern in der Zelle arbeiten können. Das heißt, die orthogonalen Ribosomen translatieren ausschließlich die orthogonale mRNA, die wiederrum kein Substrat für die zellulären Ribosomen ist. Die Änderung von zwei Basen in der 16S rRNA der orthogonalen Ribosomen erhöhte die Effizienz des Einbaus von nnAS gegenüber einem Stopp-Codon deutlich, was vermutlich auf eine verringerte Interaktion des mutierten Ribosoms mit dem release factor-1, einem Protein, das für die Beendigung der Translation verantwortlich ist, zurückzuführen ist. Die Mutation zweier weiterer Basen der 16S rRNA, nahe der Bindungsstelle des Anticodons der tRNAs, verbesserte die Einbaueffizienz von nnAS gegenüber Quadruplet-Codons um ein Vielfaches. Mit Hilfe dieser evolvierten Ribosomen ist es nun möglich, verschiedene Kombinationen von nnAS im selben Protein zu codieren [4]. Chin und Mitarbeiter nutzten diese Komponenten, um eine Azid- und eine Alkin- Funktion im selben Protein einzubauen, die anschließend durch eine Klickreaktion eine artifizielle redoxstabile Quervernetzung bildeten. Solche Quervernetzungen könnten z. B. dazu benutzt werden, therapeutisch relevante Proteine zu stabilisieren. 572 ▪▪▪ <strong>GIT</strong> Labor-Fachzeitschrift 9/2013 Bioanalytik
Ready-to-use Reagenzien ... Abb. 3: Zelluläres und orthogonales Ribosom arbeiten parallel, aber unabhängig, in einer Zelle. Schwarze Pfeile zeigen starke und gestrichelte, graue Pfeile keine Interaktionen an. Wt-mRNA: Wildtyp messenger RNA, O-mRNA: orthogonale messenger RNA, Wt-rRNA: Wildtyp ribosomale RNA, O-rRNA: orthogonale ribosomale RNA. Ausblick Bisher konnten mit der Erweiterung des genetischen Codes schon viele neue Funktionalitäten in Proteine eingebaut und für verschiedenste Anwendungsbereiche genutzt werden. Trotzdem sind noch längst nicht alle Anwendungsmöglichkeiten erschlossen und für eine bessere Nutzbarkeit wäre eine größere Vielfalt an Funktionalitäten wünschenswert. Zukünftige Arbeiten in diesem Bereich können auch darauf abzielen, die vorgestellten Techniken zu nutzen, um neue Codons mit ihren dazugehörigen Synthetase/tRNA Paaren zu entwickeln und so mit Hilfe der orthogonalen Ribosomen mehrere nnAS oder andere Monomere, die nicht mit den α-L-Aminosäuren verwandt sind, in Proteine einzubauen. Die Rolle der tRNA als Adapter zwischen der Codierung des Protein durch die mRNA und der eigentlichen Proteinbiosynthese durch das Ribosom sorgt für die chemische Unabhängigkeit von Produkt und Vorlage. Diese Unabhängigkeit sollte es möglich machen auch beliebige Kombinationen von Monomeren, bis hin zu völlig nichtnatürlichen Polymeren herzustellen, ohne dabei die klassische Art der Speicherung der Bauanleitung über DNA / RNA zu verändern (Abb. 3). Die kombinierte Biosynthese könnte in der Zukunft zur Herstellung von neuen Materialien und Therapeutika Verwendung finden. Literatur [1] Neumann H.: FEBS Lett. 586, 2057–2064 (2012) [2] Okuda S. et al.: Science 338F 1214–1217 (2012) [3] Chakraborty A. et al.: Science 337, 591–595 (2012) [4] Wang K. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 2288–2297 (2012) Kontakt | Heinz Neumann Georg-August Universität Göttingen Institut für Mikrobiologie und Genetik Göttingen hneumann@uni-goettingen.de ... und CHEMIKALIEN für jeden und den speziellen Bedarf! Direkt und kostenfrei bestellen unter 0800/5699 000 oder bestellungen@carlroth.de oder www.carlroth.de Mehr Informationen zum Thema: http://bit.ly/RNA-Technologie Bioinformatik-Tools: http://www.expasy.org Lehrbuch: http://bit.ly/1fgbrZ6 Laborbedarf - Life Science - Chemikalien Carl Roth GmbH + Co. KG Schoemperlenstraße 3-5 - 76185 Karlsruhe Tel: 0721/5606 0 - Fax: 0721/5606 149 info@carlroth.de - www.carlroth.de Bioanalytik <strong>GIT</strong> Labor-Fachzeitschrift 9/2013 ▪▪▪ 573
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