E-Paper - GIT Verlag

Die Bindung von Testsubstanzen an Proteine
wird mit dem direct peptide reactivity
assay (DPRA) untersucht. Hierbei wird
die Bindung der Substanz an Peptide (als
Ersatz für Proteine) gemessen, indem die
Peptide mit der Substanz inkubiert werden
und danach das nicht gebundene Peptid
bestimmt wird. Die Reifung von DZ wird
mit dem sogenannten h-Clat (human-Cell
Line Activation Test) oder Mmusst (modified
myeloid U937 skin sensitization test) untersucht.
Das Prinzip beruht auf der Messung
der Expression bestimmter Oberflächenmarker
(CD86 bzw. CD54) auf gereiften dendritischen
Zellen THP-1 bzw. U937[3]. Die
Aktivierung von Keratinozyten kann mittels
keap1/Nrf2 basierten Methoden ermittelt
werden, ein Beispiel ist im Folgenden
beschrieben.
Luciferase-Vektor als
Indikator für zellulären Stress
Die von der RWTH Aachen zusammen mit
der BASF und dem Unternehmen Promega
entwickelte Reportergenzelllinie „Lusens“
wandelt elektrophilen und oxidativen Stress
in der Zelle in ein Lumineszenzsignal um.
Hierzu wurde ein modifizierter Luciferase-
Vektor stabil in eine Keratinozyten-Zelllinie
transfiziert. Der Vektor wird von dem antioxidant-response-element
(ARE) kontrolliert,
das ARE wird wiederum von Nrf2 aktiviert.
Eine allergieauslösende Substanz kann in der
Zelllinie Nrf2 freisetzen und so zu einer Expression
der Luciferase führen [4]. In unserem
Versuchsaufbau wurden die Lusens - Zellen
für zwei Tage unter Standardbedingungen mit
der Testsubstanz im Brutschrank inkubiert.
Darauf folgend wurde die Luciferaseaktivität
durch Zugabe eines Substrats bestimmt, das
durch die Luciferase ein Lumineszenzsignal
erzeugt. Eine ähnliche Methode wurde von
der Schweizer Firma Givaudan entwickelt [5].
Weight-of-Evidence Ansatz
Der DPRA und der Lusens-Assay eignen
sich gut, um Allergene mit hoher Sensitivität
zu bestimmen. Daraus folgend kann
man davon ausgehen, dass bei einem negativen
Ergebnis im DPRA und dem entwickelten
Assay mit hoher Wahrscheinlichkeit
von einer nichtsensibilisierenden Substanz
gesprochen werden kann. Jedoch werden
manchmal auch unbedenkliche Substanzen
als Allergene eingestuft. Deshalb wurde ein
dritter Test, der die Reifung dendritischer
Zellen misst, hinzugenommen.
Stimmen die Ergebnisse der drei Tests
nicht überein, wird ein Weight-of-Evidence
Ansatz angewandt (Abb. 1): Mindestens zwei
von drei Tests müssen positiv sein, um die
Substanz als Allergen einzustufen, beziehungsweise
mindestens zwei von drei Tests
müssen negativ sein, um die Substanz als
nicht sensibilisierend zu beurteilen.
Um die Leistungsfähigkeit dieser Kombination
der drei Methoden zu prüfen, wurden
54 Substanzen untersucht deren allergenes
Potential beim Menschen bekannt ist.
Die Ergebnisse der in vitro Methoden wurden
mit der tatsächlichen allergenen Wirkung
am Menschen verglichen. Jeder Test
allein hatte eine Vorhersagegenauigkeit um
80%. Der LuSens zusammen mit den zwei
anderen Methoden erreichte eine Vorhersagegenauigkeit
von 94 %.
Ausblick
Eine Vielzahl verschiedener in vitro Methoden
zur Prüfung der sensibilisierenden
Wirkung wird derzeit entwickelt [1]. Da eine
einzelne Methode den komplexen Prozess
der Hautsensibilisierung nicht ausreichend
abbilden kann, werden Kombinationen verwendet,
die die einzelnen Schritte nachbilden.
Die vorgestellte Testbatterie konnte für
54 Substanzen die sensibilisierende Wirkung
beim Menschen besser voraussagen als der
gebräuchliche Tierversuch, der LLNA [6]. Sie
ist schon heute einsetzbar und wurde bereits
für einige Substanzbewertungen im Rahmen
der europäischen Chemikalienregulierung,
Reach, verwendet. Die Methoden sollen nun
weiterentwickelt werden, um nicht nur zuverlässig
anzeigen zu können, ob eine Substanz
ein Allergen ist, sondern auch wie stark
die allergene Wirkung ist.
Referenzen bei den Autoren erhältlich.
Kontakt |
Christian Walczuch
Pressereferent
Promega GmbH
Mannheim
Tel.: 0621/8501-183
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