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Abb. 3: Der SNP309 ist im ersten Intron an
Position 309 des Mdm2-Gens lokalisiert und
verstärkt die Bindungsaffinität des Transkriptionsaktivators
Sp1 an den Mdm2-Promotor 4,5 .
nase, und p53 wird dephosphoryliert 1-4 .
Die E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität von Mdm2
zielt auf beide Proteine ab und veranlasst die
Ubiquitinierung von p53 und Mdm2 selbst
für den Abbau durch Proteasome. Dementsprechend
ist auch die Expression von Mdm2
aufgrund des degradierten p53 gehemmt,
womit beide Proteine im Gleichgewicht in
der Zelle vorliegen (Abb. 1) 5 .
Eine Überexpression des Mdm2-Proteins
kann somit onkogen wirken. Der natürlich
vorkommende Single Nukleotid Polymorphismus
SNP309 (Abb. 3), bei welchem
ein Nukleotidaustausch von T nach G an
Position 309 im ersten Intron des Mdm2-
Promotors stattgefunden hat, erhöht die
Affinität für die Bindung des zellulären Sp1-
Transkriptionsfaktors. Daraus resultierend
ergibt sich ein zellulär erhöhtes Niveau des
Mdm2-Proteins, wodurch wiederum der
p53-Signalweg abgeschwächt wird. Die übermäßige
Mdm2-Expression verhindert die
Dissoziation des p53-Mdm2-Komplexes. Das
notwendige Transkriptionsprogramm zur
DNA-Reparatur kann somit nicht gestartet
werden, schadhafte DNA wird unkontrolliert
vermehrt und kann zur Tumorbildung
führen 1, 4-6 .
Experimentdesign zum
SNP309-Nachweis
Die für den PCR-Ansatz benötigte DNA
wurde durch die neuartige DC-Technologie
A B C
B L I T Z L I C H T
aus verschiedenen Patientenproben isoliert.
Diese verbindet einen sehr schnellen und
hocheffizienten Lyseschritt mit einer extrem
effizienten Bindung der Nukleinsäure an
einer festen Phase. Die DNA-Aufreinigung
ist in ca. 30 Minuten abgeschlossen.
Die Vervielfältigung des Wildtyp- und des
mutanten Mdm2-Allels erfolgte anschließend
unter Anwendung der rapid-PCR
im SpeedCycler. Hierbei wurde die Differenzierung
der parallelen Amplifikation
aufgrund sequenzspezifischer Sonden mit
unterschiedlicher Farbstoffmarkierung
realisiert. Nach einer Laufzeit von ca. 25 Minuten
konnte die vollständige Reaktion mit
40 Zyklen abgeschlossen werden.
Auf chemische und oft auch limitierende
Additive konnte bewusst verzichtet werden,
da die Geschwindigkeit ausschließlich
durch den apparativen Aufbau gewährleistet
wird und nicht von den eingesetzten
Reagenzien abhängig ist.
Die darauffolgende Endpunktdetektion
(Abb. 4 A) beider Flurophore im Endpunktdetektor
SpeedScan wurde in wenigen Minuten
durchgeführt. Da der SpeedScan vier
verschiedene Filtereinheiten beinhaltet, ist
die kompakte Messeinheit in der Lage, die
Detektion eines breiten Spektrums PCR-typischer
Fluoreszenzfarbstoffe abzudecken.
Die Analyse des SNP erfolgte nach der
Definition des Plattenlayouts (Abb. 4 B)
automatisch und wird in Kombination
mit den Messergebnissen in einem separaten
Fenster dargestellt (Abb. 4 C).
Auswertung der SNP-Diagnostik
mit ASpectFA
Die Abbildungen 4 und 5 zeigen die klare
Unterscheidung zwischen Wildtyp, heterozygoten
und homozygot mutanten Proben,
sowohl im SNP-Layout der Gerätesoftware
als auch in der parallel dargestellten Grafik
(Abb. 5). Basis für die Differenzierung der
unterschiedlichen Proben ist eine neuartige
und zum Patent angemeldete Methode.
Durch den Vergleich beider Fluoreszenzsi-
Abb. 4: Neben den aufgenommen Messwerten, ermöglicht die SpeedScan-Software weitere hilfreiche
Varianten (A-C) der Ergebnisdarstellung, womit durchgeführte Analysen auf einen Blick
erfasst werden können. A: Screening der gemessenen Proben (grün = Wildtyp-Allel; orange =
mutantes Allel); B: Layout der 36-Well-Mikroplatte zur automatischen SNP-Diagnostik; C: Ergebnisdarstellung
der Auswertesoftware ASpectFA-SNP
gnale kann eindeutig bestimmt werden, ob
das Mdm2-Gen homozygot oder heterozygot
vorliegt. Die Gegenüberstellung beider
Abbildungen veranschaulicht die enormen
Vorteile der Schnelligkeit, Übersichtlichkeit
und Funktionalität der Produktkombination
aus SpeedCycler und SpeedScan mit zugehöriger
Analysensoftware.
In nur einer Stunde kann somit eine vollständige
SNP-Diagnostik einschließlich der
DNA-Isolation realisiert werden. Zusätzlich
ist das Kontaminationsrisiko im Anschluss
Abb. 5: SNP-Diagnostik der gemessenen
Fluoreszenzsignale des Wildtyps und des mutanten
Allels verschiedener Patientenproben
(1-9), 1-3 Wildtyp, 4-6 Heterozygot, 7-9 Homozygot
mutant
an die PCR auf ein Minimum reduziert,
da das Öffnen der Mikroplatte vollständig
entfällt.
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[7] http://en.wikipedia.org/wiki/Mdm2 [09.07.2007]
[8] http://en.wikipedia.org/wiki/P53 [09.07.2007]
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12 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT