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eingespart, und es werden keine unnützen oder irreführenden Daten erhoben. PCR-Setup Der Bereich, in dem die PCR-Vorbereitung erfolgt, also Mastermix und DNA/RNA-Proben zusammengeführt werden, ist strikt vom Detektionsbereich zu trennen. Im übrigen gelten hier die gleichen Richtlinien wie für den Probenisolierungsbereich genannt. In der modernen PCR-Methodik ist ein Pipettieren der Proben auf Eis bei 4 °C nicht mehr erforderlich, denn es werden sogenannte HotStart-Taq-Polymerasen verwendet. Diese B L I T Z L I C H T PCR Base Line Subtracted CF RFU 10000 1000 100 10 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Cycle Abb. 2: CT-Shift in degradierten RNA-Proben, Qualitätskontrolle mit dem Experion TM Microfluidic system (Bio-Rad Laboratories GmbH) und anschließende Amplifikation mit dem iQ5 TM Real-Time-PCR-System 6 . �� intakt degradiert Enzyme sind initial inaktiv und werden erst durch einen einleitenden Hitzedenaturierungsschritt bei 95° C bis 98° C unmittelbar vor der PCR-Reaktion aktiviert. Je nachdem, ob antikörperassoziierte oder chemisch modifizierte Taq-Polymerasen verwendet werden, dauert die initiale Aktivierung von 15 Sekunden bis zu 15 Minuten. Durch den HotStart ist gewährleistet, dass beim ersten Anbinden der genspezifischen Startermoleküle (Primer) an die Ziel-DNA/cDNA unmittelbar die gewünschte Neustrangsynthese durch die Taq-Polymerase erfolgt. Wenn es darum geht, möglichst uniforme und gut reproduzierbare Ergebnisse zu erzie- Kennziffer 28 LW 05 · Informationen ordern? · www.biocom.de �� len, ist die Verwendung von Fertigreagenzien zu empfehlen. Diese unterliegen strengen Qualitätskontrollen und verwenden hochwertige Einzelkomponenten und optimierte Puffer, die eine maximale Produktausbeute garantieren. Primer-Stammlösungen sollten in TE-Puffer gelagert werden, und ein wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden. Idealerweise wird eine solche Primer-Stammlösung einmalig in kleinere Einheiten abgefüllt, bei –20° C gelagert und die Portionen nur einmalig aufgetaut. Die als Gebrauchslösung verdünnten Primer werden für einen begrenzten Zeitraum von weniger als 10 Tagen �� 36 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 �� LABORWELT 10000 1000 100 PCR Base Line Subtracted CF RFU 10000 1000 100 10 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Cycle 10000 1000 100 �
B L I T Z L I C H T Kennziffer 29 LW 05 · Informationen ordern? · www.biocom.de � bei 4° C gelagert und im PCR-Prozess verwendet. Gleichermaßen wird mit DNA-Standards und positivem und negativem Kontrollmaterial verfahren. Um Konzentrationsverluste der titrierten DNA-Standards zu vermeiden, kann mit einer Hintergrund-DNA oder -RNA gearbeitet werden. Diese stammt aus einer anderen Spezies und hat keinerlei Homologie zu den zu amplifizierenden Zielgenen der spezifischen DNA oder RNA. Schließlich soll hier auch noch die Temperaturgradientenfunktion genannt werden, über die viele Thermocycler verfügen. Der Temperaturgradient hilft dabei zu überprüfen, bei welcher Annealingtemperatur die spezifischen Primermoleküle ihre maximale Bindung zur Zielstrang-DNA und damit ihre höchstmögliche Amplifikationseffizienz erzielen. Fast-PCR Um eine möglichst schnelle und sichere PCR zu erzielen, lassen sich Standard-PCR-Applikationen auf einfache Weise beschleunigen, ohne dass die Verwendung von speziellen Verbrauchsmaterialien, Reagenzien oder PCR-Geräten erforderlich ist. Die hohen Heiz-/Kühlraten der modernen PCR-Geräte spielen dabei eine untergeordnete Rolle. Eine große Bedeutung haben jedoch die speziell für die Fast-PCR konstruierten Primer, deren Design es ermöglicht, dass sie bereits bei einer hohen Temperatur um 70° C, also im Temperaturoptimum der Taq-Polymerase, an die gewünschten Zielsequenzen binden. Die Amplifikationsprodukte sollten klein sein (80-150bp), um eine vollständige Neusynthese aller Komplementärstränge zu erreichen. Aus einer klassischen 3-Schritt-PCR: (HotStart: 95° C x 3 min, Denaturierung: 95° C x 15 s, Annealing: 62° C x 30s x 35 Wiederholungen, Neustrangsynthese: 72° C x 30 s) lässt sich sehr einfach eine schnelle 2-Schritt-PCR entwickeln (HotStart: 98° C x 30s, Denaturierung: 92° C x 1s, Annealing/Neustrangsynthese: 70° C x 5s x 35 Wiederholungen). Während die klassische Polymerase-Kettenreaktion eine Laufzeit von 90 Minuten hat, reduziert sich dieser Zeitraum in der beschriebenen Fast-PCR auf unter 30 Minuten. Als Kary Mullis die PCR-Methode erfand, wurden die PCR-Produkte ausschließlich mit klassischer Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen. PCR-Detektion und quantitative real-time PCR Die modernen PCR-Systeme bieten die Möglichkeit des gelfreien Nachweises der PCR-Produkte mit dem wenig toxischen SYBR-Green oder fluoreszierenden Hybridisierungssonden mittels quantitativer real-time PCR. Die dazu verwendeten real-time PCR-Systeme verwenden Halogen- oder LED-Licht und Fluoreszenzfilter, um die PCR-Produkte in jedem Zyklus der PCR zu messen. Es wird dadurch ein großer dynamischer Detektionsbereich für Proben unterschiedlichster DNA-Mengen erzielt. Im Vergleich mit DNA-Standards bekannter Quantität lassen sich unbekannte Proben absolut quantifizieren, das heißt, ihnen kann mit hoher Genauigkeit eine DNA-Ausgangsmenge im Vergleich mit den bekannten Standards zugewiesen werden. Im Bereich der Genexpression ist es üblich, die zu untersuchenden Gene (Kandidatengene) mit sogenannten Referenzgenen (Gene, die bekanntermaßen keiner Regulation unterliegen) zu vergleichen und anhand von Rechenalgorithmen die n-fache Regulation dieser Kandidatengene zu berechnen. Die hierzu entwickelten Softwareprogramme bieten zur Auswertung Algorithmen nach Livak 7 , Pfaffl 8 oder Vandesompele 9 an. Die Unterschiede bestehen darin, ob nur Kennziffer 30 LW 05 · Informationen ordern? · www.biocom.de � www.bio.analytik-jena.de | biosolutions@analytik-jena.de LABORWELT 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 | 37 SpeedMill �� The biotech industry is a challenging business. Long lead times, high development expenses and high project failure rates are facts of life. An ever-changing market environment contributes to the uncertainties. In this book Johanna Holldack presents an approach for using project management in the biotech industry and elucidates the methodology and organization. Project Management for the Biotechnology Industry E68.00, Berlin 2006, ISBN 3-928383-25-6 Tel. +49 (0)30/26 49 21-40, Fax +49 (0)30/26 49 21-11 eMail service@biocom.de Web www.biocom.de Glückskekse haben’s in sich BIOTECHNICA - Gewinnspiel von Analytik Jena Preise im Wert von 8000 EUR FlexCycler Spielen Sie mit Halle 9 | Stand E76 SpeedCycler �� Anzeige 275x210_7Project-M.indd 1 22.11.2006 11:58:19 Uhr
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