PDF Download - Laborwelt

PCR/Probenvorbereitung
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B L I T Z L I C H T
Hochempfindliche Detektion
viraler Nukleinsäuren
Dr. Hermann Nieper, LUA Sachsen, Standort Leipzig: Dr. Andrea Ockhardt, Invitek GmbH,
Berlin; Dr. Arja Lamberg, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnland
Dieser Anwendungsbericht beschreibt die Isolierung und Detektion des Erregervirus der Bovinen
Virusdiarrhoe mit Hilfe des InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL (Invitek) und des Magnetpartikelprozessors
Thermo Scientific KingFisher mL (Thermo Fisher Scientific) in Kombination
mit dem Echtzeit-RT-PCR-Detektionsverfahren. Für dieses Experiment wurden Probenpools
aus Rinderblut von maximal 50 Tieren hergestellt. Bis zu 15 Proben wurden automatisch im
KingFisher mL verarbeitet. Die Ergebnisse belegen, dass mit Hilfe dieses Verfahrens selbst ein
geringes Vorkommen viraler RNA nachgewiesen werden kann.
Eine schnelle Detektion und Quantifizierung
von Viren in der Veterinärmedizin kann zur
effizienteren Bekämpfung von Seuchen wie
der Vogelgrippe beitragen. Die hierfür eingesetzten
Diagnoseverfahren müssen eine sehr
hohe Effizienz und Sensitivität bei der Isolierung
und Detektion von Nukleinsäuren in
umfangreichen Individual- oder Probenpools
aufweisen.
Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe/Mucosal
Disease (BVD-MD) – auch als BVDV bezeichnet
– tritt sehr häufig bei Mastrindern auf
und verursacht in dieser Branche große Verluste.
Aufgrund der komplexen Pathogenese und
des schleichenden Fortschritts der BVDV-Infektion
stellt die Laboranalyse einen wesentlichen
Faktor bei der Entwicklung von Maßnahmen
zur Kontrolle und Prävention von Infektionen
dar. Akute Infektionen immunkompetenter
Tiere können zu unterschiedlichen klinischen
Symptomen führen, darunter Leistungsabfall,
Diarrhoe (Diarrhoevirus), respiratorische und
reproduktive Störungen (Fehlgeburten und
Fehlbildungen) bis hin zum tödlich verlaufenden
Hämorrhagischen Syndrom. Des weiteren
führt die mit der Infektion einhergehende
Immunsuppression zu opportunistischen
Infektionen und genereller Immunschwäche.
Das Virus verbreitet sich über Nasal- und
Oralsekrete sowie über Kot, Urin und Sperma
infizierter Tiere, doch erfolgt die Ansteckung
zumeist über persistent infizierte (PI) Tiere.
Zur persistenten Infektion kommt es im Falle
einer intrauterinen Ansteckung während des
ersten Drittels der Trächtigkeit, also vor der
Entwicklung der Immunkompetenz. PI-Tiere
sind während ihres gesamten Lebens infiziert
und weisen hohe Viruskonzentrationen ohne
jegliche Immunreaktion auf.
Prävention und Kosten
Die deutsche Bundesregierung schätzt den
finanziellen Verlust pro Kuh auf ca. a160
(BMELF 1998). Laut Wolf (1997) kann sich
der finanzielle Verlust einer tödlich verlaufenden
Infektion bei einem Bestand von
100 Tieren auf bis zu a12.000 belaufen. Seit
November 2004 ist BVD in Deutschland eine
anzeigepflichtige Tierkrankheit. Mit der für
2007 erwarteten Verabschiedung einer Bundesverordnung
zur BVD-Bekämpfung wird
für jedes Tier eine tierärztliche Untersuchung
vorgeschrieben werden, um die Ausbreitung
Tab. 1: Pipettierschema für KingFisher mL und InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL
Röhrchen Inhalt Proben-/ Reagenzienvolumen
A Lysierte Probe
MAP Solution A*
1Bindungslösung
der Seuche einzudämmen. Das primäre Ziel
der BVD-Bekämpfung ist die Erkennung
und Vernichtung aller PI-Tiere, die ca. 0,1%
bis 2,0% des gesamten Rinderbestandes ausmachen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist ein
wirtschaftliches, schnelles, sinnvolles und
sicheres Detektionsverfahren nötig. Detektionsverfahren
anhand von Viruskultivierung
und Antigen-ELISAs haben den Nachteil, dass
Abb. 1: Der Thermo Scientific KingFisher mL-
Magnetpartikelprozessor
20 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT
200 µl
20 µl
400 µl
B Waschpuffer R1 800 µl
C Waschpuffer R2 800 µl
D Waschpuffer R2 800 µl
E Elutionspuffer R 120 µl
sie bei großen Tierbeständen nicht einsetzbar
oder aber sehr kostenintensiv sind. Mit RT-
PCR-basierten Verfahren hingegen lassen
sich Mischproben (Pools) von bis zu 50 Tieren
untersuchen.
Im Jahr 2002 wurde in Sachsen ein freiwilliges
Programm zur BVD-Bekämpfung
anhand eines RT-PCR-Verfahrens eingeführt.
2004 wurde das Verfahren modernisiert und
um eine semi-automatische Reinigung der
Serumpools mit Hilfe des Thermo Scientific
KingFisher mL in Kombination mit dem
Invitek InviMag Virus DNA/RNA Mini
Kit/KFmL ergänzt. Im Vergleich zum Einsatz
vollautomatischer Instrumente bietet
dieses System einen wichtigen Schritt hin
zur kostengünstigen Standardisierung der
bislang sehr arbeitsaufwendigen Reinigung
von Nukleinsäuren im Labor.
Isolierung viraler RNA
Die virale RNA des BVD-Virus wird innerhalb
von 45 Minuten mit Hilfe des InviMag ® Virus
DNA/RNA Mini Kit/KFmL aus Serum- und
Plasmapools gereinigt. Die Serum- und Plasmapools
bestehen aus Rinderblutproben, die
direkt beim tierhaltenden Betrieb entnommen
werden. Die Qualität der verwendeten Proben
kann je nach Alter und Gesundheitszustand
des Tieres sowie entsprechend verschiedener
Lager- und Transportbedingungen der Proben
stark schwanken. Zur Herstellung eines
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