PDF Download - Laborwelt

Liquid Handling
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B L I T Z L I C H T
Schnelle Zyklen und geringe
Kosten: Nanoliter-PCR
Holger Eickhoff, SCIENION AG, Dortmund;
Andreas Dahl, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin
Die Kombination hochpräziser Dispenser im Piko- und Nanolitervolumenbereich und
stark miniaturisierter Mikrotiterplattenformate ermöglicht die Durchführung von PCR-
Reaktionen in Nanolitervolumina. Die kleinen Volumina erlauben schnelle Heiz- und
Kühlschritte und die Durchführung einer kompletten PCR in weniger als 10 Minuten.
Dabei werden im Vergleich zu Standardsystemen typischerweise maximal 10% der sonst
üblichen Reagenzienmengen eingesetzt, was insbesondere im Hochdurchsatzbetrieb zu
massiven Kosteneinsparungen führt. Kombiniert mit einer Online-Detektion für Real-time-
oder Endpunktbestimmung ermöglicht die hier vorgestellte Kombination einen sensitiven,
kosteneffektiven und schnellen Nachweis von Nukleinsäuren.
Die Miniaturisierung von PCR-Reaktionen
ist ein Forschungsfeld, welches in zwei
generellen Ansätzen verfolgt wird. Neben
Durchflusssystemen, bei denen sich ein
kleiner Kanal durch mehrere Heiz- und
Kühlzonen windet, werden in einem weiteren
Ansatz auch miniaturisierte Mikroplattensysteme
für PCR im Submikroliterbereich
verwendet. Dabei gilt in beiden Ansätzen,
dass das Verhältnis von Reaktoroberfläche
zu Reaktionsvolumen im Gegensatz zu
konventionellen Ansätzen stark in Richtung
einer großen Oberfläche verändert wird. Dies
führt zu effizienterer Wärmeübertragung auf
das Reaktionsgemisch und ermöglicht so die
Durchführung einer kompletten PCR in nur
wenigen Minuten.
Damit PCR-Reaktionen im Nanoliterbereich
(nano-PCR) erfolgreich durchgeführt werden
können, müssen sowohl die Präsenz
von die Polymerasen inhibierenden Stoffen
als auch die biochemischen Wechselwirkungen
zu der vergrößerten Kontaktfläche mit
dem Reaktionsgefäß minimiert werden.
Während Durchflusssysteme und weiter
integrierte Lab-On-A-Chip-Systeme große
Skalierungseffekte durch die Verwendung
von Siliziumtechnologie und der damit verbundenen
günstigen Herstellung solcher
Strukturen in der Zukunft versprechen,
ist in den meisten Labors die Verwendung
von PCR-Mikroplattensystemen Realität.
Durchflusssysteme sind in der Regel geschlossene
Systeme mit einem nicht standar-
Abb. 2: Online-Volumenbestimmung von
dispensierten Tropfen. Mit einem Stroboskopblitzlicht
werden dispensierte Tropfen
angeleuchtet und mit einer CCD-Kamera live
aufgenommen. Die gezeigte Bildschirmaufnahme
ist ein Ausschnitt aus der sciFLEXAR-
RAYER-Software, auf dem die Düseneinstellungen
links oben (blau hinterlegt: Pulshöhe
88 Volt, Pulslänge 48 µs, Tropfenfrequenz 500
Hertz), das Livebild der CCD-Kamera mit dem
automatisch identifizierten Tropfen rechts
(Tropfenschwerpunkt im Fadenkreuz) und
das dispensierte Volumen von 285 Pikolitern
unten links angezeigt werden
disierten Interface für die Probenaufgabe,
die spezifisch für einen bestimmten Assay
gefertigt werden. Im Gegensatz dazu sind
miniaturisierte Mikroplattensysteme offene
Plattformen, die mit geeigneten Dispensern
leicht und – wenn nötig – mehrfach befüllt
werden können und so für eine Vielzahl von
Assays nutzbar sind. Die Verwendung von
offenen Kavitäten in PCR-kompatiblem Polypropylenmaterial
erlaubt dabei eine freie
Auswahl von einzelnen Reaktionsplätzen
und die Adaptierbarbeit an verschiedene
Assays und Detektionssysteme (Abb. 1).
Diese im Vergleich zu geschlossenen Systemen
größere Flexibilität in der Applika-
Abb. 1: Links: Parallele Bestückung der nano-PCR-Platten mit vier Dispensern auf einem gekühlten sciFLEXARRAYER-Probenhalter zur Vermeidung
von Evaporation und Kondensation. Rechts: Detailaufnahme während der Abgabe von Probengemischen in einzelne Kavitäten. Abstand der
Kavitäten: 1mm.
28 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT