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A
B
Gegenstück , welches an einen Chip gekoppelt
ist. Verwendung vieler verschiedener
Sequenzen am Chip ermöglicht die großflächige
vergleichende Analyse der Probe;
derzeit werden bis zu 35.000 solcher Sequenzen
in einem charakteristischen Muster am
Chip aufgebracht, weshalb sich der Name
Microarray eingebürgert hat. Eine Sequenz
nimmt eine Fläche von etwa 100x100 µm ein.
Zum Nachweis der gebundenen Proben wird
üblicherweise das Probenmaterial mit einem
Farbstoff markiert, der dann fluoreszenzmikroskopisch
detektiert wird.
Aufgrund der sehr geringen Mengen an genetischem
Material, das für die meisten Analysen
zur Verfügung steht, wird oft ein Amplifi-
zierungsschritt vorgeschaltet – die Polymerase-Kettenreaktion
(Polymerase Chain
Reaction, PCR). Dabei werden vor der Farbmarkierung
multiple identische Kopien der
DNA angefertigt. Dieser für die Genomanalyse
kritische Schritt birgt allerdings auch die
größten methodischen Probleme: während
der Verstärkung kann es zu signifikanten
Verzerrungen der relativen Anteile der
W I S S E N S C H A F T
Abb. 2. A. Illustration des Aufbaus. Ein Laser wird nach Anpassung des Strahlprofils in das Mikroskop
eingekoppelt. Die Probe wird in Epi-Konfiguration über interne Totalreflexion beleuchtet
und die emittierte Fluoreszenz durch dasselbe Objektiv gesammelt. Als Detektor haben wir eine
hochsensitive, „backilluminierte“ CCD-Kamera verwendet. B. Schema des Auslesprozesses. Die
Probe („Kaffekanne“) und deren Abbildung am Detektor („Kaffetasse“) werden synchron durch
den belichteten Bereich verschoben. Dadurch gelangt Fluoreszenzlicht aus demselben Probenbereich
immer in denselben Bildbereich, und wird aufsummiert, bis das Ende des Kamerachips
erreicht ist; dort erfolgt der Ladungstransfer in das Ausleseregister.
Sequenzen kommen 3 . So erwies es sich als
besonders schwierig, die sehr häufigen GC-
Inseln zu verstärken. Darüber hinaus ist die
Durchführung der Amplifizierungsschritte
zeitaufwendig.
Detektion einzelner Moleküle
Wir verfolgten einen alternativen Ansatz,
der es uns ermöglichen sollte, eine nicht verzerrte
genetische Analyse von geringen Probenmengen
zu erhalten. Ziel unseres Projektverbundes
aus Genetikern, Immunologen,
Medizinern, Mathematikern, elektrischen
Messtechnikern und Industriepartnern war
es, die Sensitivität der verwendeten Nachweisinstrumente
bis zu den prinzipiellen
Grenzen auszureizen, um somit auf eine
Amplifizierung des genetischen Materials
verzichten zu können. Wir konnten dazu
auf Technologie-Entwicklungen der letzten
Jahre aufbauen, die die Abbildung selbst
einzelner Farbstoffmoleküle ermöglichten 4 .
Abbildung 1 (Seite 13) zeigt solche Einzelmoleküle
in Falschfarbendarstellung. Der
optische Abbildungsprozess lässt die Moleküle
als durch die Lichtbeugungsgrenze
limitierte Signalverteilungen erscheinen;
deren Breite von ca. 200 nm ist durch die
verwendete Lichtwellenlänge sowie die
Abbildungseigenschaften des Mikroskops
bestimmt. Die Höhe der Einzelmolekülsignale
übersteigt das Hintergrundrauschen
deutlich (Signal-zu-Rauschverhältnis ~30),
so dass im Wesentlichen alle sich an der
Oberfläche befindenden Moleküle auch
detektiert werden (>99%).
Die für Einzelmolekül-Experimente von
uns konstruierten Geräte basieren auf einem
Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit
Lasern als Lichtquellen sowie einer „backilluminierten“,
mit flüssigem Stickstoff
gekühlten CCD-Kamera als Detektor (Abb.
2). Besondere Sorgfalt in der Auswahl der
Komponenten – insbesondere der optischen
Filter – ermöglicht eine Detektionseffizienz
des gesamten Gerätes von bis zu 10%. Der
angeregte Zustand von typischen Farbstoffen
weist eine Lebensdauer von etwa
1 ns auf, das heißt, es können maximal 10 9
Photonen von einem solchen Molekül pro
Sekunde emittiert werden. Die erreichbare
Emissionsrate kann sich allerdings deutlich
durch das Auftreten weiterer nichtstrahlender
Übergänge reduzieren; meist steht
auch die benötigte Anregungsintensität von
mehreren kW/cm 2 nicht zur Verfügung. Real
kann man von rund 10 5 -10 6 emitierten beziehungsweise
etwa 10 4 -10 5 detektierten Photonen
pro Sekunde und Molekül ausgehen.
Wird also die Belichtungszeit auf wenige
Millisekunden reduziert, ist noch ein Signal
von einigen hundert Photonen zu erwarten,
welches auf modernen, „backilluminierten“
Kameras eindeutig nachgewiesen werden
kann.
Die hohe Sensitivität des Gerätes erfordert
die Verwendung hochwertiger Abbildungsoptiken.
Eine optimale Detektion ist nur
möglich, wenn an der Auflösungsgrenze von
rund 200 Nanometern gearbeitet wird. Umgekehrt
haben Biochips typische Abmessungen
von mehreren Zentimetern. Wenn nun
pro Gensequenz eine Fläche von 100x100
µm am Microarray angenommen wird, ist
mit typischerweise 10 Milliarden Bildpunkten
pro Microarray zu rechnen. Diese Zahl
übersteigt bei weitem die maximale Anzahl
von Bildpunkten einer Digitalkamera. Wir
entschieden uns daher, den Biochip in einem
Rasterverfahren abzubilden. Dieses Abbildungsverfahren
sollte allerdings zeitlich
kompatibel zu herkömmlichen Geräten sein,
welche für das Auslesen eines Biochips ca.
15 Minuten benötigen. Deshalb verwendeten
wir ein für solche Lesegeräte neuartiges
Ausleseverfahren, welches für hochsensitive
Aufnahmen in der Astrophysik entwickelt
Kennziffer 17 LW 05 · www.biocom.de �
14 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT