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Diagnosepools von 5 ml werden nur 100 µl<br />

Serum oder Plasma pro Tier von maximal 50<br />

Tieren verwendet.<br />

Aus jedem Pool wird ein Aliquot von 200 µl<br />

zur Isolierung viraler RNA verwendet. Hierzu<br />

wird das Aliquot in das im Kit enthaltene<br />

Extraktionsröhrchen übertragen und vorsichtig<br />

mit 200 µl ddH O vermischt. Dieses<br />

2<br />

Extraktionsröhrchen verfügt innen über<br />

eine Beschichtung aus einer vorbereiteten<br />

Mischung fester Lysereagenzien (nicht-chaotroper<br />

Lysepuffer und Proteinase K), Carrier-<br />

Nukleinsäuren und präzise abgemessener<br />

interner RNA/DNA-Extraktionskontrollen.<br />

Die internen Kontrollen wurden mit den<br />

Zielsequenzen zusammen aufgereinigt und<br />

Norm. Fluoro.<br />

ermöglichen die Beurteilung der Extraktionseffizienz<br />

beziehungsweise der PCR-Amplifizierung.<br />

Hierdurch werden die Qualität<br />

der gereinigten Virus-RNA und/oder DNA<br />

sichergestellt und falsch-negative Ergebnisse<br />

0,1 ausgeschlossen.<br />

Nach dem Mischen werden sämtliche<br />

Proben für 15 Minuten bei 65 °C in einen<br />

Schüttelinkubator gegeben, um die Aktivität<br />

0,05 der Proteinase bei der Lyse des Viruskapsids<br />

und der Proteindigestion zu unterstützen.<br />

Zur Entfernung von Proteinresten von den<br />

Virusnukleinsäuren wird darüber hinaus<br />

eine Inkubation von 10 Minuten bei 95 °C<br />

0<br />

empfohlen. Dieser Schritt ist insbesondere<br />

bei sehr stabilen Virusnukleinsäure-Protein-<br />

Komplexen 0 10notwendig. 20 30 40<br />

Während der Lyse ist für jede Probe ein<br />

KingFisher mL-Röhrchenstreifen negative Probe in die<br />

Probenhalterung einzusetzen. Dann werden<br />

die Röhrchenstreifen B bis E gemäß Tabelle 1<br />

mit den mitgelieferten Puffern befüllt. Nach<br />

Abschluss der Lyse werden die Proben in<br />

die KingFisher mL-Röhrchenstreifen über-<br />

tragen (Röhrchen A), und es werden 400 µl<br />

Bindungslösung und 20 µl Magnetpartikellösung<br />

A hinzugefügt und mit jedem Lysat<br />

gemischt, um optimale Bindungsbedingungen<br />

herzustellen.<br />

Unter diesen Bedingungen wird die Virus-RNA<br />

quantitativ an die Magnetpartikel<br />

gebunden. Anschließend werden die Magnetpartikel<br />

in den Waschpuffer R1 und R2<br />

übertragen, um sämtliche Verunreinigungen<br />

wie Proteine, Nukleasen, PCR-Inhibitoren etc.<br />

zu entfernen. Nach der Entfernung des Ethanols<br />

von den Partikeln wird die Virus-RNA<br />

in Elutionspuffer R eluiert und ist bereit zur<br />

weiteren Verwendung.<br />

Nach dem Befüllen der Röhrchenstreifen<br />

Norm. Fluoro.<br />

wird das Tablett im Gerät plaziert und die<br />

Kammspitzen eingesetzt. Die Frontabdekkung<br />

0,05 wird geschlossen und die Proben mit<br />

dem „InviMAG-Virus-KFmL“-Reinigungsprotokoll<br />

verarbeitet. Nach Abschluss des<br />

Programms werden die Eluate zur weiteren<br />

Verwendung gelagert.<br />

positive Probe positive Probe<br />

BVDV-Detektion<br />

Schwellenwert Schwellenwert<br />

Norm. Fluoro.<br />

0,3<br />

0,25<br />

0,2<br />

0,15<br />

0,1<br />

0,05<br />

0<br />

Schwellenwert<br />

Standardmäßig wird ein Aliquot von 5 µl von<br />

jedem Eluat (1/24) zur BVDV-Detektion bei<br />

Probenpools von 50 Tieren verwendet. Primer<br />

und 0Bedingungen<br />

der Echtzeit-One-Step-RT-<br />

PCR beschreiben Gaede et al. Dieses System<br />

ermöglicht eine zuverlässige Detektion selbst<br />

bei nur 0 10 Genomkopien 10 20 pro Reaktion 30 und 40<br />

entspricht den Sensitivitätsanforderungen Zyklus<br />

der Bundesregierung. negative Dies entspricht Probe einer<br />

Verdünnung von mindestens 1 zu 1.000 bei<br />

jeder PI-Probe (Abb. 1).<br />

Des Weiteren wurde ein quantitativer Assay<br />

durchgeführt, um sicherzustellen, dass auch<br />

bei verdünnten Pools eine ausreichende Vi-<br />

Abb. 1: Amplifizierung der Verdünnungsreihe einer Kontroll-Nukleinsäure (rot; von links nach<br />

rechts 10.000/1.000/100/10 Kopien in Serumproben) und parallele Verdünnungsreihe von zwei<br />

PI-Tieren (persistent infizierte Tiere, grün; unverdünnte Serumprobe/1:10/1:100/1:1000 verdünnte<br />

Serumprobe), amplifiziert mittels Echtzeit-RT-PCR.<br />

22 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT<br />

Zyklus<br />

Genomkopien<br />

10 5<br />

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zyklus<br />

PI-Tier 1:10 1:100 1:1000<br />

10 3<br />

10 2<br />

10 1<br />

negativ

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