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B L I T Z L I C H T
PCR
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Keine unvorhergesehenen
Ereignisse mehr bei PCR und
quantitativer real-time PCR
Dr. Marcus Neusser, Bio-Rad Laboratories, München
Seit der Erfindung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 1,2 -Methode durch Kary Mullis 1985,
für die dieser 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt, wurde diese Methode zu einem der bedeutendsten
Handwerkszeuge der modernen Molekularbiologie. Die PCR dient der spezifischen
Amplifikation von RNA/DNA-Sequenzen, zu deren Nachweis und neuerdings auch zu deren
exakter Quantifizierung mittels quantitativer real-time PCR und Fluoreszenzmarkierung.
Neueste technologische Entwicklungen dienen dem quantitativen Nachweis seltener Proteine
mit Immuno-PCR 3,4 und dem schnellen Nachweis von Einzelbasenaustauschen 5 , sogenannten
SNPs. Die SNPs sind unter anderem Indikatoren spezifischer Krankheitsbilder und haben
prognostische Bedeutung dafür, ob und wie hoch das individuelle Erkrankungsrisiko ist. Viele
Anwender der PCR-Methode sind bereits einmal den „Geistern“ in der PCR begegnet. Gemeint
sind damit „unerklärliche“ Ergebnisse wie falsch-positive Nachweise oder die Amplifikation
unerwünschter PCR-Produkte, die eine Konkurrenz zu den eigentlichen spezifischen PCR-
Produkten darstellen. Auch das Ausbleiben jeglicher Amplifikationsprodukte unterliegt dem
Einfluss dieser vermeintlichen „PCR-Geister“. Dieser Beitrag soll helfen, unerwünschte PCR-
Resultate zu vermeiden. Zugleich ist er Anleitung, effektive Maßnahmen zu ergreifen, um den
unerklärlichen Phänomenen auf den Grund zu gehen.
Anwender, für die die PCR eine neue Methodik
darstellt, unterschätzen häufig die hohe
Nachweisempfindlichkeit und das damit
einhergehende Risiko falsch-positiver und
artifizieller PCR-Ergebnisse. Bereits bei der
Probenisolierung sollten bestimmte Richtlinien
eingehalten werden, um Frustration und
Verwirrung in den nachfolgenden Schritten
zu vermeiden. Der Laborbereich, in dem die
Probenaufarbeitung (DNA-/RNA-Isolierung)
durchgeführt wird, ist räumlich strikt von den
übrigen Laborbereichen, in denen die Amplifikation
und der Nachweis der PCR-Produkte
erfolgt, zu trennen. Es werden in allen Bereichen
ausschließlich gestopfte Pipettenspitzen
und nicht gepuderte Handschuhe verwendet;
PCR-Wasser sollte kommerziell bezogen und
in kleinen Mengen zum Einmalgebrauch gelagert
werden. Laborbekleidung und Pipetten
verbleiben im jeweiligen Laborbereich, um
ein Verschleppen von PCR-Endprodukten
in den Bereich der Probenisolierung und
Abb.1: SmartSpec TM Plus Spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories GmbH)
34 | Kennziffer 8. Jahrgang | Nr. 26 5/2007 LW 05 · www.biocom.de
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