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wurde. Dabei werden sowohl Probe als auch
die am Detektor akkumulierten Ladungen
synchron bewegt. Somit kann die Aufnahme
selbst einer beliebig großen Chipoberfläche
kontinuierlich erfolgen, ohne zeitaufwendige
Positionierungsschritte 5 .
Ultra-sensitives mRNA-Profiling
Die Anwendung des Gerätes auf Microarrays
erwies sich zunächst als nicht ganz
einfach. Aufgrund der hohen Sensitivität
des von uns entwickelten Detektors beobachteten
wir zunächst viele gebundene,
fluoreszierende Biomoleküle, selbst auf
unbehandelten Biochips. Offenbar waren
alle kommerziell erhältlichen Trägermaterialien
den hohen Ansprüchen an die Reinheit
nicht gewachsen. Wir entwickelten daher
Biochips mit einer wesentlich verbesserten
Reinheit 6 – im Mittel befinden sich nur
etwa 25 unspezifisch adsorbierte Moleküle
innerhalb der Fläche eines DNA-Spots von
100 µm Durchmesser 5,7 .
Weiters stellten sich völlig neue Anforderungen
an die Software zur Datenanalyse.
Während marktübliche Microarrays gewöhnlich
nur auf die Helligkeit der einzel-
W I S S E N S C H A F T
Abb. 3: Ein DNA-Microarray, auf Einzelmolekül-Ebene ausgelesen. Die einzelnen Spots entsprechen
verschiedenen Gen-Sequenzen. Eine Ausschnittvergrößerung des Bildes zeigt einzelne
helle Signale, die den einzelnen fluoreszierenden cDNA-Molekülen entsprechen.
nen Spots untersucht werden, können in
unserem Fall die Moleküle gezählt werden,
was sich als viel genaueres Verfahren erwies.
Projektpartner vom Fuzzy Logic Laboratory
der Universität Linz entwickelten dafür die
vollautomatischen Analyseroutinen.
Damit stand einer Anwendung – also der
Charakterisierung einer typischen Probe,
wie sie im Routinebetrieb eines Analyselabors
auftreten könnte – nichts mehr im Wege.
Dieses Experiment wurde gemeinsam mit
unseren Partnern vom Fachbereich für molekulare
Biologie der Universität Salzburg
durchgeführt. Um die hohe Sensitivität der
Plattform zu demonstrieren, wählten wir
zur Untersuchung nur 200 ng totale RNA
– also eine hundertfach geringere RNA-
Ausgangsmenge als mit herkömmlichen
Geräten gerade noch messbar wäre. Die
Probe wurde auf einem Microarray aus 125
unterschiedlichen 67-70mer Oligonukleotiden,
welche in acht Replikaten gespottet
wurden, hybridisiert und ausgelesen (Abb.
3). Wir fanden einerseits hochexprimierte
Gensequenzen, welche eine homogene
Signalverteilung über dem Spot bewirkten.
Diese Gene wurden mit konventionellen
Methoden ausgewertet. Für viele Gene war
jedoch die Konzentration so niedrig, dass
nur mehr einige wenige cDNA-Moleküle
binden konnten (siehe Inset); in diesem Fall
wurden für eine quantitative Analyse die
Moleküle gezählt. Die Auswertung lieferte
exakt die gleichen Resultate wie eine Vergleichsmessung
an hundertfach höheren
Ausgangsmengen mit einem kommerziellen
Gerät 7,8 .
Auch Proteindetektion möglich
Die Anwendung der hier vorgestellten
Technologie ist nicht beschränkt auf genetische
Fragestellungen. So ist die Kenntnis
des menschlichen Erbgutes nur der erste
Schritt zu einer vollständigen Entschlüsselung
von Zellfunktionen. Den wesentlichen
zweiten Schritt stellt die Charakterisierung
des im Genom kodierten Proteoms – des
Proteingehalts einer Zelle in bestimmten
Stadien ihrer Entwicklung – dar. Für Proteine
existiert keine der PCR vergleichbare
Methode zur Probenamplifizierung. Gerade
in diesem Bereich wird ein Chip-Lesegerät
mit Einzelmolekül-Sensitivität Grundvoraussetzung
für viele diagnostische sowie
grundlagenwissenschaftliche Fragestellungen
sein.
Literatur
[1] Van‘t Veer, L.J., Paik, S., Hayes, D.F. Gene Expression Profiling of Breast
Cancer: a new Tumor Marker, j. Clin. Oncol 23, 1631-1635 (2005)
[2] Bogaerts, J., Cardoso, F., Buyse M., Braga S., Loi, S., Harrison, J.A.,
Bines, J., Mook, S., Decker, N., Ravdin, P., Therasse, P., Rutgers, W. ,
Van‘t Veer, L.J., Piccart, M. on behalf of the TRANSBIG consortium. Gene
Signature Evaluation as a Prognostic Tool: Challenges in the Design of
the MINDACT trial. Nat. Clin., Proct. Oncol. 10, 540-551 (2006)
[3] Mutter, G.L., Bonyton, K.A. PCR Bias in Amplification of Androgen receptor
Alleles, a Trinucleotide Repeat Marker Used in Clonality Studies.
Nucleic Acids Res. 23, 1421-1428 (1995)
[4] Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J. & Schindler, H.
Imaging of single molecule diffusion. Proc Natl Acad Sci USA 93, 2926-
9. (1996).
[5] Hesse, J., Sonnleitner, M., Sonnleitner, A., Freudenthaler, G., Jacak, J.,
Hoglinger, O., Schindler, H. & Schutz, G. J. Single-molecule reader for
high-throughput bioanalysis. Anal Chem 76, 5960-4 (2004).
[6] Schlapak, R., Pammer, P., Armitage, D., Zhu, R., Hinterdorfer, P., Vaupel,
M., Fruhwirth, T. & Howorka, S. Glass surfaces grafted with high-density
poly(ethylene glycol) as substrates for DNA oligonucleotide microarrays.
Langmuir 22, 277-85 (2006).
[7] Hesse, J., Jacak, J., Kasper, M., Regl, G., Eichberger, T., Winklmayr, M.,
Aberger, F., Sonnleitner, M., Schlapak, R., Howorka, S., Muresan, L.,
Frischauf, A. M. & Schutz, G. J. RNA expression profiling at the single
molecule level. Genome Res 16, 1041-5 (2006).
[8] Mir, K. U. Ultrasensitive RNA profiling: counting single molecules on
microarrays. Genome Res 16, 1195-7 (2006).
Korrespondenzadresse
Dr. Gerhard J. Schütz
Institut für Biophysik
Johannes Kepler-Universität Linz
Altenbergerstr. 69
A-4040 Linz
Dr. Jan Hesse
Zentrum für Biomedizinische
Nanotechnologie
Upper Austrian Research GmbH
Scharitzerstr. 6-8, A-4020 Linz, Austria
16 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABORWELT