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Jefe de línea / Group Leader: Jesús Vázquez Química de proteínas y proteómica Protein chemistry and proteomics B7 Publicaciones Publications CBM 2005/2006 52 Postdoctorales / Postdoctoral: Margarita Villar Inmaculada Jorge Becarios Predoctorales / Predoctoral Fellows: Daniel López-Ferrer Salvador Martínez-Bartolomé Antonio Ramos-Fernández Horacio Serrano Pedro Navarro Pablo Martínez Científicos Visitantes / Visiting Scientists: Mónica Carrera (IIM-CSIC, Vigo) Biología Celular Cell Biology Resumen de investigación Las nuevas estrategias cuantitativas basadas en la cromatografía multidimensional en línea con espectrometría de masas y dilución con isótopos estables de 18 O son técnicas orientadas al análisis de péptidos que están emergiendo como alternativas más robustas y sensibles que las técnicas electroforéticas convencionales para el análisis dinámico del proteoma. No obstante, la identificación y cuantificación masivas de péptidos requieren un alto grado de automatización a nivel experimental y en los algoritmos de análisis de datos. Estamos trabajando en la implementación y desarrollo de este tipo de técnicas y su aplicación al estudio de los cambios dinámicos que tienen lugar en el proteoma endotelial durante la angiogénesis y al análisis de modificaciones postraduccionales inducidas por estrés nitrosativo en endotelio. Hemos desarrollado un conjunto integrado de herramientas bioinformáticas que incluye un programa de validación totalmente automático (pRatio), que selecciona las identificaciones correctas entre los péptidos identificados en bases de datos a partir de sus espectros de fragmentación, y un programa de cuantificación (QuiXoT), que calcula los cambios de expresión e introduce un algoritmo innovador para calcular la eficiencia de marcaje. En un experimento representativo, hemos identificado y determinado los niveles relativos de más de 1.000 proteínas (5.000 péptidos) en células HUVEC estimuladas con el factor proangiogénico VEGF durante 4 y 8 horas. Se han identificado cambios de expresión en proteínas que responden a estímulos externos o están implicadas en la comunicación celular, incluyendo moléculas de adhesión. Mediante técnicas parecidas hemos conseguido determinar varias docenas de proteínas potencialmente nitrosiladas y la caracterización de un sitio de nitración en tirosina en modelos de estrés oxidativo in vitro. Nuestros resultados podrían contribuir al desarrollo de las técnicas de Proteómica de Segunda Generación y mejorar nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a dos importantes procesos en el endotelio, un elemento clave del sistema cardiovascular. Figura1. Cuantificación de péptidos utilizando isótopos estables a partir de la envoltura isotópica. (D) Determinación de la eficiencia de marcaje. Cuantificación de dos proteínas a partir de dos péptidos cada una (E,F y G,H). Figure 1. (A-C) Peptide quantification by stable isotope labeling from the isotopic envelope. (D) Determination of labeling efficiency. Quantification of two proteins from two different peptides each (E,F and G,H). Research summary Quantitative strategies relying on multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry and 18 O- stable isotope labeling are peptide-centric techniques that have emerged as more robust and sensitive alternatives to the well-established gel-based techniques for the study of the dynamic proteome. Nevertheless, high-throughput peptide identification and quantification experiments require highly automated setups and data-processing algorithms. We are working in the implementation and development of these techniques and their application to the study of dynamic changes in the endothelial cell proteome during angiogenesis and to the analysis of posttranslational modifications induced in endothelium by nitrosative stress. We have developed an integrated set of bioinformatics tools that includes a fully automated validation program (pRatio), which selects positive matches among tentative peptide identifications in databases from MS/MS data, and a quantification program (QuiXoT), which calculates expression ratios and introduces an innovative algorithm for computing labeling efficiency. In a representative experiment, we have identified and determined relative expression changes of more than 1.000 proteins (5.000 peptides) in HUVEC cells after 4 and 8h-estimulation with the angiogenic factor VEGF. Changes in relative expression levels were detected in proteins responding to external stimuli and involved in cell communication, including cell adhesion molecules. A similar approach allowed the identification of several dozens of potentially nitrosylated proteins and the characterization of a tyrosine-nitration site using in vitro models of oxidative stress. Our results may contribute to the development of Second Generation Proteomics and could improve our knowledge of the molecular mechanisms underlying two important processes in the vascular endothelium, a key component of the cardiovascular system. Figura 2. Cuantificación relativa de péptidos a gran escala mediante cromatografía multidimensional (A). Distribuciones del peso estadístico (B) y de la razón de concentraciones (C). Figure 2. Relative high-throughput quantification of peptides by multidimensional chromatography. Distributions of statistical weight (B) and concentration ratios (C). Díaz, G., Cañas, B., Vázquez, J.,Nombela, C. and Arroyo, J. (2005). Characterization of natural peptide ligands from HLA-DP2: new insights into HLA-DP peptide binding motifs. Immunogenetics. 56, 754-759. Ortega, I., Cano, E., Were, F., Villar, M., Vázquez, J. and Redondo, J. M. (2005). c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) positively regulates NFATc2 transactivation through phosphorylation within the N-terminal regulatory domain. J. Biol. Chem. 280, 20867-20878. Martínez-Ruiz, A., Villanueva, L., González de Orduña, C., López- Ferrer, D., Vázquez, J and Lamas, S. (2005). S-Nitrosylation of Hsp90 promotes the inhibition of its ATPase and eNOS regulatory activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 8525-8530. López-Ferrer, D., Capelo, J. L. and Vázquez, J. (2005). Ultrafast trypsin digestion of proteins by high intensity focused ultrasound. J. Proteome Res. 4, 1569-1574. López-Ferrer, D., Ramos-Fernández, A., Martínez-Bartolomé, S., García-Ruiz, P. and J. Vázquez, J. (2006). Quantitative proteomics using 16O/18O labeling and linear ion trap mass spectrometry. Proteomics. 4, S4-S11. Villar, M., Ortega-Pérez, I., Were, F., Cano, E., Redondo, J. M. and Vázquez, J. (2006). Systematic characterization of phosphorylation sites in NFATc2 by linear ion trap mass spectrometry. Proteomics. 4, S16-S27. Hernández Fernaud, J. R., Marina, A., González ,K., Vázquez, J. and Falcón, M. A. (2006). Production, partial characterization and spectroscopic study of the extracellular laccase activity from Fusarium proliferatum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 70, 212-221. Martínez-Martínez, S., Rodríguez, A., López, M. D., Vázquez, J. and Redondo, J. M. (2006). Blockade of NFAT activation by the second calcineurin-binding site. J. Biol. Chem. 281, 6227-6235. Carrera, M., Cañas, B., Piñeiro, C., Vázquez, J. Gallardo, J. M. (2006). Identification of commercial hake and grenadier species by proteomic analysis of the parvalbumin fraction 2. Proteomics. 6, 5278-5287. López-Ferrer, D. Cañas, B, Vázquez, J., Lodeiro, C., Rial-Otero, R., Moura, I. and Capelo, J. L. (2006). Sample Treatment for Protein Identification by Mass Spectrometry-Based Techniques. Trends Anal. Chem. 25, 996-1005. Patentes Patents “Digestión ultrarrápida de proteínas mediante ultrasonidos focalizados”. Autores: José Luis Capelo, Daniel López-Ferrer y Jesús Vázquez. Presentada en la Oficina Portuguesa de Patentes (2005). “Selective acceleration process for macromolecular fragmentation through joint application of enzymes and ultrasounds”. Filed with the International Bureau of the World Intellectual Property Organization (RO/IB) (PCT application, 7 july 2007). Authors: José Luis Capelo, Jesús Vázquez, Daniel López-Ferrer e Isabel Moura. “Método para el análisis cuantitativo comparativo de proteomas mediante marcado isotópico estable y espectrometría de masas”. Autores: Antonio Ramos, Daniel López-Ferrer y Jesús Vázquez (20 octubre 2006). Presentada en la Oficina Española de Patentes, NSOL 200602685. “Procedimiento para la identificación de las especies comerciales de la Familia Merlucciidae, elementos necesarios y aplicaciones”. Autores: Mónica Carrera, José Manuel Gallardo, Carmen Piñeiro, Benito Cañas, Daniel López y Jesús Vázquez (27 diciembre 2006; 16,28 p.m.) Presentada en la Oficina Española de Patentes. N. Registro: 200603287. 53
CInmunología y Virología Immunology and Virology Estructura cristalográfica de la retrotranscriptasa del VIH-1. Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase. C1 / 56 Transmision de señales a través del receptor para el antígeno de células T Signal transduction through the T cell antigen receptor Balbino Alarcón C9 / 72 Retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana y terapia antirretroviral Human inmunodeficiency virus reverse transcriptase and antiretroviral therapy Luis Menéndez Arias C2 / 58 Bases moleculares de la patogenia y del potencial anti-cáncer viral Molecular bases of viral pathogenesis and anti-cancer potential José M. Almendral C10 / 74 Regulación de la expresión génica en endotelio vascular Regulation of gene expression in vascular endothelium Juan Miguel Redondo Moya C3 / 60 Bases moleculares de la citopatología viral y fúngica Molecular bases of viral and fugal citopathology Luis Carrasco C11 / 76 Desarrollo hematopoyético en el embrión de ratón post-gastrulación Hematopoietic development in the post-gastrulation mouse embryo Miguel A Rodríguez Marcos C4 / 62 Variabilidad genética de virus RNA Genetic variability of RNA viruses Esteban Domingo Solans C12 / 78 Virus de la peste porcina africana African swine fever virus María Luisa Salas C5 / 64 Activación del sistema inmune Activation of the immune system Manuel Fresno C13 / 80 Replicación y transcripción del DNA del fago ø29 Replication and transcription of phage ø29 DNA Margarita Salas C6 / 66 C7 / 68 C8 / 70 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas Stability and Engineering of Viral Proteins Mauricio García Mateu Replicación del DNA y ciclo celular DNA replication and cell cycle Crisanto Gutiérrez Mecanismo de asociación de HLA-B27 con espondiloartritis Mechanismo of associaton of HLA-B27 with spondyloarthropathies José A. López de Castro C14 / 82 C15 / 84 Desarrollo de nuevas estrategias para el control y prevención de enfermedades virales: el virus de la fiebre aftosa como modelo New strategies for prevention and control of viral diseases: foot-and-mouth disease virus as a model Francisco Sobrino Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano Development of the human lymphohematopoietic system María Luisa Toribio García
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