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Jefe de Línea / Group Leader: Luis Carrasco Bases moleculares de la citopatologia viral y fúngica Molecular bases of viran and fugal citopathology C3 Publicaciones Publications Resumen de investigación Research summary Sanz, M.A., Madan, V., Nieva, J.L. and Carrasco, L. (2005). The alphavirus 6K protein. In: Fischer, W (ed) Viral Membrane Proteins: Structure, Function, and Drug Design. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. pp. 233-244. CBM 2005/2006 60 Postdoctorales / Postdoctoral: María Vanesa Madam Susana Molina Becarios Predoctorales / Predoctoral Fellows: Raquel Blanco Alfredo Castelló Patricia García Marta Ramos Almudena Ortiz Pablo del Moral Ewelina Welnowska Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Carmen Hermoso Fátima Palomares Diana Pisa Miguel Angel Sanz Inmunología y Virología Immunology and Virology El principal objetivo de nuestro grupo es el análisis de proteínas virales que producen daño en las células de mamífero durante la replicación viral. Nos hemos centrado en dos grupos de proteínas citopatogénicas virales: proteasas y viroporinas. Además, recientemente hemos comenzado una nueva línea de investigación dirigida a elucidar la presencia de infecciones fúngicas como posibles causantes de diversas enfermedades humanas de origen desconocido. Implicación del factor de iniciación eIF4G en la traducción de diversos mRNAs. Algunas especies de virus contienen una proteasa capaz de hidrolizar el eIF4G, bloqueando la traducción de mRNAs celulares. Se han desarrollado diversos métodos para la expresión de la proteasa 2A del virus de la polio en células de mamífero. Uno de ellos consiste en la electroporación de un mRNA conteniendo el IRES del virus EMC seguido del gen de la 2A. Con este método se puede hidrolizar de forma diferencial el eIF4GI y el eIF4GII y estudiar el efecto diferencial en la traducción de diversos mRNAs. Las viroporinas. Las viroporinas son proteínas de pequeño tamaño, muy hidrofóbicas, que oligomerizan e interaccionan con membranas formando poros. Se han descubierto y analizado la función de nuevas viroporinas tales como la E de Coronavirus y la p7NS4a del virus de la hepatitis C. Hemos estudiado la acción de diversos péptidos derivados de la viroporina 2B de poliovirus, encontrando que un péptido de pequeño tamaño es capaz de mimetizar la acción de la 2B. Citopatología fúngica. La levadura Candida famata está implicada en la etiología de la retinopatía zonal oculta (AZOOR). Es posible que ésta u otras levaduras relacionadas estén implicadas en la causa de otras enfermedades humanas cuya etiología se desconoce. Hemos desarrollado diversos ensayos para determinar la presencia de infección fúngica diseminada en muestras de sangre. Así, se ha determinado que diversos pacientes de AZOOR y de coroiditis serpiginosa muestran una infección fúngica diseminada. Figura 1. Inhibición por proteínas virales del transporte de mRNAs celulares del núcleo al citoplasma Figure 1. Inhibition by viral proteins of cellular mRNA transport from nucleus to cytoplasm. The main goal of our research group is to study viral proteins that induce damage in mammalian cells during viral replication. We have focused on two types of cytopathogenic viral proteins: proteases coded by animal viruses and viroporins. More recently we have started a new line of research aimed to elucidate the aetiology of several human diseases and the potential implication of fungal infection. Implication of the initiation factor eIF4G in the translation of different mRNAs. Some picornavirus and retrovirus species encode for a protease capable to cleave eIF4G, leading to its inactivation to translate cellular mRNAs. Several methods have been developed to express poliovirus protease 2A in mammalian cells. One of these methods consists in electroporation of an mRNA that contains the EMCV IRES followed by 2A gene. With this method, there is a differential cleavage of both isoforms of eIF4G (GI and GII), depending on the amount of electroporated mRNA. Viroporins. These virus-encoded proteins are of small size, very hydrophobic, that oligomerize and interact with membranes leading to pore formation. We have uncover and anlyze new viroporins, such as the Coronavirus E protein and p7 and NS4a from hepatitis C virus. On the other hand, we have studied the activity of a number of peptides derived from poliovirus 2B viroporin. We have found that a small peptide is able to mimic the activity of 2B. Fungal cytopathology. The yeast Candida famata is involved in the aetiology of acute zonal occult outer retinopathy (AZOOR). Probably, this one or other related species are also involved at the cause of other human diseases of unknown aetiology. We have developed several assays to determine the presence of disseminated fungal infection from blood samples. Thus, we have determined that AZOOR and choroiditis serpiginosa patients show signs of disseminated fungal infection. Publicaciones Publications Madan, V., Sanz, M.A. and Carrasco, L. (2005). Requirement of the vesicular system for membrane permeabilization by Sindbis virus. Virology. 332, 307-315. Perales, C., Carrasco, L. and González, M.E. (2005). Regulation of HIV-1 env mRNA translation by Rev protein. Biochem. Biophys. Acta. 1743, 169-175. Ventoso, I., Navarro, J., Muñoz, M.A. and Carrasco, L. (2005). Involvement of HIV-1 protease in virusinduced cell killing. Antiviral Research. 66, 47-55. Carrasco, L., Ramos, M., Galisteo, R., Pisa, D., Fresno, M. and González, M.E. (2005). Isolation of Candida famata from a patient with acute zonal occult outer retinopathy. J. Clin. Microbiol. 43, 1730-1734. Madan, V., de Jesús, M., Sanz, M.A. and Carrasco, L. (2005). Viroporin activity of murine hepatitis virus E. protein. FEBS Lett. 579, 3607-3612. González, M.E. and Carrasco, L. (2005). Viral proteins that enhance membrane permeability. In: Fischer, W (ed) Viral Membrane Proteins: Structure, Function, and Drug Design, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. pp. 79-90. Castelló, A., Sanz, M.A., Molina, S. and Carrasco, L. (2006). Translation of Sindbis virus 26S mRNA does not require intact eukaryotic initiation factor 4G. J. Mol. Biol. 355, 942-956. Ventoso, I., Sanz, M.A., Molina, S., Berlanga, J.J., Carrasco, L. and Esteban M. (2006). Translational resistance of late alphavirus mRNA to eIF2 phosphorylation: A strategy to overcome the antiviral effect of protein kinase PKR. Genes and Development. 20, 87-100. Berlanga, J.J., Ventoso, I., Harding, H.P., Deng, J., Ron, D., Sonenberg, N., Carrasco, L. and de Haro, C. (2006). Antiviral effect of the mammalian translation initiation factor 2a kinase GCN2 against RNA viruses. EMBO J. 25, 1730-1740. Álvarez, E., Castelló, A., Menéndez-Arias, L. and Carrasco, L. (2006). HIV protease cleaves poly(A) binding protein. Biochem. J. 396, 219-226. Castelló, A., Álvarez, E. and Carrasco, L. (2006). Differential cleavage of eIF4GI and eIF4GII in mammalian cells. Effects on translation. J. Biol. Chem. 281, 33206-33216. Almendral, J.M. and Carrasco, L. (2006). Concepto de virus e historia de la Virología. In: Carrasco, L. and Almendral J.M. (eds) Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 29-40. Carrasco, L. and Almendral, J.M. (2006). Taxonomía y clasificación de virus. In: Carrasco L. and Almendral J.M. (eds). Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 41-51. Carrasco, L. and Irurzun, A. (2006). Tipos de infección viral y alteraciones en la célula. In: Carrasco, L. and Almendral, J.M. (eds) Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 117- 136. Carrasco, L. and. Feduchi, E. (2006). El ciclo lítico viral. In: Carrasco, L, and Almendral, J.M, (eds). Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 137-161. Carrasco, L. and Irurzun, A. (2006). Picornaviridae. In: Carrasco, L. and Almendral, J.M. (eds). Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 327-346. Enjuanes, L., Carrasco, L. and Díez, J. (2006). Coronaviridae, Togaviridae, Flaviviridae. In: Carrasco, L. and Almendral, J.M. (eds). Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 347-375. Carrasco, L. and Feduchi, E. (2006). Los interferones. En Virus patógenos. In: Carrasco, L. and Almendral, J.M. (eds). Virus patógenos. Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid, pp. 537-551. Virus patógenos. Carrasco, L and Almendral, J.M. (eds.). (2006). Editorial Hélice y Fundación BBVA. Madrid. Tesis doctorales Doctoral Theses Susana Molina Arranz. (2005). Traducibilidad de los RNAs mensajeros del virus Sindbis. Efecto de la brefeldina A. Raquel Blanco Fuentes. (2005). Caracterización de la actividad citotóxica de la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. María Vanesa Madan Renes. (2006). Viroporinas de virus animales con genoma RNA. María Isabel Pacheco Santos. (2006). Interacción de Candida famata con células en cultivo y animales de experimentación. 61
Jefe de Línea / Group Leader: Esteban Domingo Solans Variabilidad genética de virus RNA Genetic variability of RNA viruses C4 CBM 2005/2006 62 Personal Científico / Scientific Staff: Cristina Escarmís Homs Postdoctorales / Postdoctoral: Celia Perales Viejo Verónica Martín García Armando Arias Esteban Juan Francisco García Arriaza Noemí Sevilla Hidalgo Becarios Predoctorales / Predoctoral Fellows: Rubén Agudo Torres Macarena Sierra García Mónica Herrera Quintana Marta Sanz-Ramos Rojo Samuel Ojosnegros Martos Técnicos de Investigación / Technical Assistance: Mercedes Dávila Cerrato Gema Gómez Maríano Ana Isabel de Ávila Lucas Científicos Visitantes / Visiting Scientist: Dr. Juan Cristina Inmunología y Virología Immunology and Virology Resumen de investigación El conocimiento de las implicaciones biológicas de la dinámica de cuasiespecies víricas, requiere integrar resultados de dinámica poblacional con datos bioquímicos y estructurales. En este contexto se desarrollan los trabajos recientes de nuestro grupo, empleando los virus de la fiebre aftosa (VFA), de la coriomeningitis linfocitaria de ratón (VCML) y de la inmunodeficiencia humana (VIH-1). Varios estudios han documentado el comportamiento de las cuasiespecies como una unidad de selección. Así, genomas minoritarios memoria pueden influir en la evolución del VIH-1 en pacientes infectados. La acción de anticuerpos sobre cuasiespecies reconstruidas de VFA, ha demostrado que se selecciona una distribución de mutantes dominada por los componentes de mayor eficacia biológica (fitness). Asímismo, la transición hacia la catástrofe de error de VFA y VCML, inducida por mutagénesis, se asocia a aumentos de la complejidad de los espectros de mutantes. Genomas no infecciosos (defectores) contribuyen a la extinción de virus (defección letal). Una combinación de un agente mutagénico y un inhibidor antirretroviral permite la extinción de VIH-1 de alto fitness, lo que confirma resultados con VFA. Las bases moleculares de las altas tasas de mutación se han abordado con estudios enzimológicos y estructurales con la RNA polimerasa del VFA, en colaboración con el grupo de la Dra. N. Verdaguer. Se han puesto a punto ensayos bioquímicos con polimerasa purificada y se ha resuelto la estructura tridimensional de varios complejos de la polimerasa con polímeros iniciadores de la replicación. Como aplicación al diagnóstico, hemos desarrollado un microarray de oligonucleótidos que permite diferenciar variantes antigénicos del VFA. En estos proyectos han colaborado con nuestro grupo los de los Dres. M.A. Martínez, C.López-Galíndez, E.Lázaro, S.Manrubia , C.Briones, J.Gomez, J.Cristina y J.C.de la Torre. Figura 1. RNA polimerasa del virus de la fiebre aftosa en un complejo con VPg (rojo), poli A (amarillo) y el UMP incorporado (verde) (de Ferrer-Orta et al. 2006). Figure 1. RNA polymerase of foot-and-mouth disease virus in a complex with VPg (red), poly A (yellow) and incorporated UMP (green) (from Ferrer-Orta et al. 2006). Research summary Knowledge of the biological implications of the dynamics of viral quasispecies necessitates the integration of results on population dynamics with biochemical and structural data. This is the basic premise of the work in our laboratory, using foot-and-mouth disease virus (FMDV), lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and human immunodeficiency virus (HIV-1) as model systems. Several studies have documented the behaviour of viral quasispecies as a unit of selection. For example, minority, memory genomes may affect HIV-1 evolution in infected patients. Antibodies acting on reconstituted FMDV quasispecies select mutant distributions dominated by the components with the highest fitness. Likewise, the mutagenesis-induced transition of FMDV and LCMV into error catastrophe is associated with increases of mutant spectrum complexity. Non-infectious genomes (termed defectors) may contribute to virus extinction (lethal defection). A combination of a mutagen and an antiretroviral inhibitor can extinguish high fitness HIV-1, confirming previous results with FMDV. The molecular bases of high mutation rates have been approached with enzymological and structural studies with purified FMDV polymerase, in collaboration with the group of Dr. N. Verdaguer. We have used a number of biochemical assays, and have solved the three-dimensional structure of several polymerase complexes. As an application to diagnosis, we have developed an oligonucleotide microarray that differentiates antigenic variants of FMDV. The projects have been carried out in collaboration with Drs. M.A.Martínez, C.López-Galíndez, E.Lázaro, C.Briones, S.Manrubia, J.Gómez, J.Cristina and J.C.de la Torre. Publicaciones seleccionadas Selected publications Domingo, E., et al. (2005). Population dynamics of RNA viruses: the essential contribution of mutant spectra. Arch. Virol. 19 [SUPP.], 59-71. Domingo, E. et al. (2005). Quasispecies dynamics and RNA virus extinction. Virus Res. 107, 129-139. Domingo, E. (2005). Antiviral strategy on the horizon. Virus Res. 107, 115-116. (Preface written as guest editor of the Special Issue of Virus Res. On “Virus entry into error catastrophe as a new antiviral strategy”, vol. 107 nº 2). Perales, C. et al. (2005). Monitoring sequence space as a test for the target of selection in viruses. J. Mol. Biol. 345, 451-459. Novella, I. et al. (2005). Adaptability costs in immune escape variatns of vesicular stomatitis virus. Virus Res. 107, 27-34 Manrubia, S. C. et al. (2005). High mutation rates, bottlenecks, and robustness of RNA viral quasispecies. Gene. 347, 273-282. Yuste, E. et al. (2005). Few mutations in the 5´leader region mediate fitness recovery of debilitated human immunodeficiency type 1 viruses. J.Virol. 79, 5421-5427. Grande-Pérez, A. et al. (2005). Suppression of viral infectivity through lethal defection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 4448-4452. García-Arriaza, J. et al. (2005). A segmented form of foot-and-mouth disease virus interferes with standard virus: a link between interference and competitive fitness. Virology. 335 155-164. Tapia, N. et al. (2005). Combination of a mutagenic agent with a reverse transcriptase inhibitor results in systematic inhibition of HIV-1 infection. Virology 338, 1-8. González-López, C. et al. (2005). Invariant aphthovirus consensus nucleotide sequence in the transition to error catastrophe. Infection Genetics and Evolution 5, 366-374. Grande-Pérez, A. et al. (2005). Mutagenesis-induced, large fitness variations with an invariant arenavirus consensus genomic nucleotide sequence. J. Virol. 79, 10451-10459. Greene, I. et al. (2005). Effect of alternating passage on adaptation of sindbis virus to vertebrate and invertebrate cells. J. Virol. 79, 14253-60. Arias, A. et al. (2005). Mutant viral polymerase in the transition of virus to error catastrophe identifies a critical site for RNA binding. J. Mol. Biol. 353, 1021-1032. Arribas, M. et al. (2005). Effect of metallic cations on the efficiency of DNA amplification. Implications for nucleic acid replication during early stages of life. International J. Astrobiol. 4,115-123. Möller, P. et al. (2005). Homo-oligomerization of Marburgvirus VP35 is essential for its function in replication and transcription. J. Virol. 79, 14876-14886. Pariente, N. et al. (2005). Action of mutagenic agents and antiviral inhibitors on foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 107, 183-193. Salguero, F.J. et al. (2005). Foot-and-mouth disease virus (FMDV) causes an acute disease that can be lethal for adult laboratory mice. Virology. 332, 384-396. Ferrer-Orta, C. et al. (2006). The structure of a protein primerpolymerase complex in the initiation of genome replication. EMBO J. 25, 880-888. Costa-Mattioli, M. et al. (2006) Analysis of sequential hepatitis A virus strains reveals coexistence of distinct viral subpopulations. J. Gen. Virol. 87, 115-118. García-Arriaza J. et al. (2006). Dynamics of mutation and recombination in a replicating population of complementing, defective viral genomes. J Mol. Biol. 360, 558-572. Manrubia, S. C. et al. (2006). Long-range transport and universality classes in in vitro viral infection spread. Europhysics Letters. 74, 547-553. Martín, V. et al. (2006). Viral fitness can influence the repertoire of virus variants selected by antibodies. J. Mol. Biol. 362, 44-54. Briones, C. et al. (2006). Monority memory genomes can influence the evolution of HIV-1 quasiespecies in vivo. Gene. 384, 129-138. Martín, V. et al. (2006). Microarray-based identification of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus: a bioinformatics quality assessment. BMC Genomics 7: 117 doi:10.1186/1471-2164-7-117. Ferrer-Orta, C. et al. (2006). A comparison of viral RNA-dependent RNA polymerases. Curr. Opin Struct Biol. 16, 27-34. Díaz-San Segundo F. et al. (2006). Selective Lymphocyte Depletion during the Early Stage of the Immune Response to Foot-and-Mouth Disease Virus Infection in Swine. J. Virol. 80, 2369–2379. Libros: Nueve referencias de libros no incluidas/ Nine references of books not included. Tesis doctorales Doctoral Theses Armando Arias Esteban. (2005). Bases poblacionales y abordaje molecular de la variación viral. Mónica Herrera Quintana. (2006). Caracterización y bases moleculares de la persistencia y la virulencia del virus de la fiebre aftosa en cultivos celulares. Patentes Patents Patente Europea P1457 EPPC concedida el 14-9-2006 con el Número 128429. Premios Awards Armando Arias Esteban, premio para Personal Investigador no en plantilla (PINP) del CBMSO concedido a la mejor Tesis Doctoral realizada en los laboratorios del CBMSO y presentada en el Departamento de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid. / Armando Arias Esteban, prize to non-staff member of CBMSO to the best Doctoral Thesis at CBMSO, presented at the Department of Molecular Biology of Universidad Autónoma de Madrid. Marta Sanz-Ramos Rojo, premio al mejor póster en categoría de calidad científica en EUROPIC 2006 Finlandia. / Marta Sanz-Ramos Rojo, prize to the best poster for scientific content at EUROPIC 2006, Finland. Esteban Domingo Solans, Director del Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA) hasta Marzo de 2005. / Esteban Domingo Solans, Director of Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA- INIA) until March, 2005. Esteban Domingo Solans, miembro fundador y miembro del comité científico del Instituto Para Limes (Países Bajos, 2006). / Esteban Domingo Solans, founder member, and scientific board member of Institute Para Limes (The Netherlands, 2006). 63
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