Drosophila - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid

Jefe de Línea /
Group Leader:
José Berenguer
Postdoctorales /
Postdoctoral:
Daniel Vega Mendoza
Becarios Predoctorales /
Predoctoral Fellows:
Felipe Cava
Emilio Blas
Eloy Ferreras
Federico Acosta
Zahra Chahlafi
Científicos visitantes /
Visiting Scientist:
Nuno Borges
Elisa Trivelloni
Diederik Johannes Opperman
Regulación de la expresión génica Regulation of gene expression
Biotecnología y genética
de bacterias termófilas extremas
Resumen de investigación
En nuestro grupo empleamos bacterias termófilas extremas
del género Thermus como modelo de laboratorio, y
tratamos de descifrar aspectos de su biología, y de
desarrollar en paralelo herramientas genéticas y métodos
que permitan su manipulación y empleo como sistemas de
producción de enzimas o de selección de formas
termoestables de éstas.
Nuestro trabajo en los últimos dos años se ha centrado en
el estudio de la regulación y maduración de las enzimas
respiratorias codificadas por un elemento genético
transferible (NCE) que confiere al portador la capacidad de
crecer anaeróbicamente con nitrato como aceptor de
electrones. Hemos demostrado que la nitrato reductasa
(Nar) codificada por el NCE posee un citocromo c, ausente
en sus homólogas mesófilas, que es necesario para su
maduración y unión a la membrana. Estos datos sugieren
que esta enzima podría constituir el ancestro común a
nitrato reductasas de membrana y periplásmicas presentes
en bacterias modernas. A nivel de regulación, hemos
encontrado que el NCE codifica dos homólogos de factores
de transcripción de las familias CRP y AfsR necesarios para
la expresión del sistema de respiración de nitrato en
respuesta a la presencia de éste compuesto y a la ausencia
simultánea de O2. En los dos próximos años pretendemos
descifrar la relación entre estos reguladores y los
mecanismos de respuesta a estas señales.
A un nivel más aplicado, hemos desarrollado vectores para
expresar enzimas en T. thermophilus de una forma
competitiva frente a los sistemas de expresión empleados
en E. coli, y vectores de plegamiento a alta temperatura con
los que pretendemos estabilizar enzimas y proteínas
termosensibles. Estas nuevas herramientas nos permiten
plantearnos proyectos de investigación en colaboración
con grupos de investigación y con empresas
biotecnológicas. Como ejemplo, hemos contribuido a
identificar la función biológica del factor de elongación de la
transcripción GfhI de T. thermophilus (Fig. 1).
Biothechnology and genetic
of extreme thermophilic bacteria
Research summary
We use extreme thermophilic bacteria of the genus Thermus
to uncover specific aspects of its biology and to develop
methods to allow its genetic analysis and use as “cell
factories”, both for the production of thermozimes and for the
selection of thermostable forms from thermosensitive ones.
During the last two years we have focused our attention on
the study of the regulation and maturation of the respiratory
enzymes encoded by a conjugative element (NCE) that
confers the capability to grow anaerobically with nitrate as
electron acceptor to its host. We have demonstrated that the
nitrate reductase (Nar) encoded by this NCE contains a
cytochrome c, absent from their mesophilic homologues,
that is required for the binding to the membrane and
maturation of the Nar. These results suggest that Nar could
constitute an ancestor of membrane and periplasmic nitrate
reductases present in modern bacteria. At the regulatory
level, we have shown that the NCE encodes two
homologues to transcription factors of the CRP and AfsR
families that are required for the expression of the anerobic
respiratory system in response to nitrate and to the absence
of O2. In the next two years we plan to decipher the
relationship between these regulators and the mechanisms
responsive to these two signals.
At a more applied level, we have developed vectors that
allow us to express enzymes in T. thermophilus in a
competitive way compared to the expression in E. coli. We
have developed also a high temperature folding vector with
which we plan to stabilize thermo-sensitive enzymes and
proteins. These new tools allow us to consider research
projects in collaboration with other groups and with biotech
companies. As an example, we have contributed to
elucidate the biological function of the transcription
elongation factor GfhI from T. thermophilus (Fig. 1).
E5
Publicaciones
Publications
Moreno, R., Haro, A., Castellanos, A. and Berenguer, J. (2005). Highlevel
overproduction of His-tagged Tth DNA polymerase in Thermus
thermophilus. Appl Environ Microbiol. 71: 591-593.
Zafra, O., Cava, F., Blasco, F., Magalon, A. and Berenguer, J. (2005).
Membrane-associated maturation of the heterotetrameric nitrate
reductase of Thermus thermophilus. J. Bacteriol. 187: 3990-3996.
Cava, F. and Berenguer, J. (2006). Biochemical and regulatory
properties of a respiratory island encoded by a conjugative plasmid in
the extreme thermophile Thermus thermophilus.
Biochem Soc Trans. 34: 97-100.
Laptenko, O., Kim, S.S., Lee, J., Starodubtseva, M,, Cava, F.,
Berenguer, J., Kong, X.P. and Borukhov, S. (2006). pH-dependent
conformational switch activates the inhibitor of transcription
elongation. EMBO J. 25: 2131-2141.
Patentes
Patents
Nuevo marcador de selección termoestable para la manipulación
genética de Thermus spp. Depósito Nº 200603279. España.
Colaboraciones con la industria
Doctoral Theses
Biotools B & M (Madrid) “Efecto de proteínas de Thermus
thermophilus recombinantes y nativas en reacciones de PCR
cualitativas y cuantitativas. Modelización en la detección de
Staphylococcus aureus y sus forma resistentes a meticilina (MRSA)”
Biomethodes (Evry, Francia) Project THR: A new technology
to improve the thermostability of proteins.
Figura 1. Efecto de la deleción de los factores de elongación de la transcripción GreA (activador) y Gfh1 (inhibidor) en la morfología de
Thermus thermophilus. Se muestra la ausencia de las proteínas GreA y Gfh1 en mutantes sencillos y dobles obtenidos mediante
el uso de un vector de inserción-escisión, así como el efecto de tales mutaciones en la morfología de cada mutante (rojo) comparado
con la estirpe silvestre (verde). Se puede apreciar el pequeño tamaño de los mutantes ∆greA, la morfología aberrante de los mutantes ∆gfh1
y la formación de agregados multicelulares por el doble mutante.
CBM 2005/2006
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Figure 1. Effect of the deletion of the transcription elongation factors GreA (activator) and Gfh1 (inhibitor) on the morphology of Thermus
thermophilus. Figure shows the absence of the GreA and Gfh1 proteins in single and double mutants obtained through the use of an insertionexcision
vector, and also the effects of such mutations on the cell morphology of each mutant (red) compared to the wild type (green).
It can be observed the small size of the ∆greA mutant, the aberrant morphology of the ∆gfh1 mutant and the formation
of huge cell aggregates in the double mutant.
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