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Tipizzazione molecolare di lieviti saccharomyces di interesse enologico
PREMESSA
L’identificazione della composizione della flora dei lieviti all’interno del mosto si rende necessaria
per il miglioramento delle caratteristiche qualitative del vino. Tradizionalmente, l’identificazione e
la caratterizzazione di specie di lievito e di specifici ceppi all’interno della stessa specie si basavano
sull’analisi di tratti morfologici e soprattutto sulle loro caratteristiche fisiologiche specifiche.
Queste caratteristiche sono però fortemente influenzate dalle condizioni di coltura e possono produrre
risultati incerti e talvolta non corretti.
Recentemente sono state sviluppate numerose tecniche molecolari innovative che costituiscono validi
metodi alternativi in grado di mettere in risalto la diversità genetica dei ceppi (Kellis et al.,2003; Richard
e Dujon 2006; Schuller et al., 2004). In tale ambito, l’amplificazione di sequenze di DNA specifiche
tramite PCR è divenuto un metodo molecolare largamente utilizzato in quanto altamente riproducibile.
A questa tecnica sono stati successivamente affiancati metodi di analisi più sensibili quali la RAPD
(Random Amplification of Polymorphic DNA) (Quesada e Cenis, 1995), la RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) (Guillamon et al.., 1998) e la AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
(Azumi and Goto-Yamamoto, 2001).
Negli anni più recenti tali tecniche sono state impiegate per lo studio della variabilità di sequenza di
alcune regioni del genoma, soprattutto di quelle in cui sono localizzati i geni che codificano per gli RNA
ribosomiali (rRNA). In particolare, sono stati analizzati i domini D1/D2 dei geni codificanti per il 26S
rRNA (Laitila et al.., 2006) e le regioni interne spaziatrici trascritte (ITS) del cluster dei geni ribosomiali
(26S, 18S e 5S) (Guillamon et al.., 1998; Granchi et al.., 1999; Esteve-Zarzoso et al.., 1999) .
L’attenzione e stata rivolta anche allo studio del polimorfismo di singoli geni specifici conservati nei
lieviti quali il 5S, Actina e Metionina 2 (Daniel e Meyer,2003; Antunovics et al.., 2005).
Ad onor del vero, nessuno di questi metodi fino ad oggi si è rivelato in grado di garantire da solo risultati
che consentano l’identificazione certa di una specie o di un ceppo di lievito.
A queste tecniche si possono affiancare altre metodiche che però presentano lo svantaggio di essere
più complesse e che possono richiedere costose apparecchiature, quali l’analisi del cariotipo mediante
l’impiego della tecnica PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (Cardinali e Martini, 1994). Va
menzionata infine l’analisi del DNA mitocondriale (mtDNA) che presenta una variabilità genetica
intrinseca maggiore rispetto al DNA nucleare.
Rimane pertanto importante identificare nuove regioni variabili del genoma che possano consentire
l’identificazione certa dei ceppi a livello della loro specie e, possibilmente, mettere in evidenza le
differenze all’interno della stessa specie.
A tale scopo, si è cercato di mettere a punto un sistema discriminante basato sull’amplificazione dei geni
ADH, presenti in tutti i lieviti, che codificano per attività alcool deidrogenasiche.
I ceppi di lievito analizzati, isolati prevalentemente dall’uva, dai mosti e dal vino, sono stati forniti
dall’Istituto Sperimentale per l’Enologia di Velletri (ora CRA-Unità di ricerca per le produzioni enologiche
dell’Italia centrale Velletri), e dal Dipartimento di Biologia Vegetale dell’Università di Perugia.
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