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Digestione degli amplificati del sistema genico AdH ottenuti per PCR
Per ottenere un pattern di identificazione molecolare più affidabile, i prodotti di PCR dei geni ADH sono
stati sottoposti a restrizione utilizzando Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza il
DNA specifico per la sequenza GATC.
Questo approccio consente di evidenziare più in dettaglio il polimorfismo di ciascun ceppo.
L’analisi è stata effettuata dapprima sul ceppo di laboratorio di riferimento BY4741 (Fig.2) e
successivamente sui ceppi della collezione di Velletri (Fig.3) e di Perugia (Fig.4).
Come si può vedere, la digestione degli amplificati genici, ottenuti sia singolarmente che insieme dal
ceppo di controllo BY4741, ha fornito una serie di frammenti di restrizione caratteristici di ciascun gene
e concordi con la loro sequenza nucleotidica.
Il pattern RFLP che si ottiene sembra essere caratteristico per ciascun ceppo in quanto questi differiscono
tra loro per la dimensione di alcuni frammenti e nel loro numero, coerentemente con il numero di geni
amplificati in ciascun ceppo.
Per quanto riguarda la collezione di Perugia, il ceppo C2 di S. cerevisiae mostra un pattern di restrizione
identico al cerevisiae di controllo, a conferma dell’affidabilità della tecnica.
Con piccole differenze, questo pattern si osserva sia nel ceppo di italicus (I2) che nei due ceppi di
chevalieri (H2, H3) che, notoriamente, sono sinonimi di cerevisiae.
Un diverso profilo è risultato comune per i ceppi U2, classificato nella collezione di Perugia come S.
uvarum, e i ceppi B1 e B2 di bayanus. Dal momento che avevamo precedentemente osservato che nel
ceppo U2 non è presente l’amplificato del gene ADH3, peculiarità mostrata anche dai ceppi di bayanus
della stessa collezione, possiamo ipotizzare che la classificazione di questo ceppo sia stata erroneamente
attribuita alla specie uvarum.
Un discorso simile può essere fatto per il ceppo U1 di uvarum che mostra un pattern di restrizione più
simile al ceppo H3 di chevalieri e al C2 di cerevisiae.
Analisi del pattern proteico delle alcool deidrogenasi
L’assenza in un determinato ceppo di lievito dell’amplificato di un gene della taglia attesa può essere
dovuta alla mancanza del gene stesso o al riarrangiamento della regione codificante del gene.
Per verificare che all’assenza dell’amplificato corrispondesse effettivamente l’assenza del gene, abbiamo
cercato di stabilire una relazione con la presenza/assenza del corrispondente enzima.
A tale scopo, dopo rottura delle cellule ed estrazione delle proteine cellulari, le singole attività ADH
sono state separate mediante elettroforesi su gel nativi di acrilamide e la loro presenza è stata messa in
evidenza mediante un saggio di attività per colorazione specifica.
I risultati di questa analisi sui ceppi della collezione di Velletri hanno mostrato, che all’assenza degli
amplificati ADH2 e ADH3 corrisponde effettivamente la mancanza delle corrispondenti attività
enzimatiche (Figura 5a). E’ interessante notare che i ceppi 1 e 4 (uvarum) mostrano un pattern enzimatico
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