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CONCLUSIONI
Per una migliore identificazione e tracciabilità dei lieviti appartenenti al genere Saccharomyces, è stato
messo a punto un nuovo approccio enzimatico-molecolare basato sull’analisi delle alcool deidrogenasi
(ADH), un sistema genico che risulta essere altamente conservato nei lieviti nel corso dell’evoluzione.
Ai fini dello studio della variabilità tra le varie specie, il sistema ADH presenta il doppio vantaggio di poter
esser analizzato sia a livello del DNA dei geni che lo costituiscono che dei loro prodotti enzimatici.
Infatti, da quanto scaturisce dalla nostra indagine, utilizzando primers basati sulle sequenze note dei
geni ADH del ceppo di S. cerevisiae di controllo si possono ottenere frammenti di DNA di taglia diversa
specifici per ciascun gene. Allo scopo di ottenere più velocemente un’impronta molecolare dei ceppi
in esame, è possibile effettuare l’amplificazione di tutti e quattro i geni contemporaneamente mediante
PCR multiplex.
Inoltre, la successiva digestione dei prodotti di PCR con l’enzima Sau3AI consente di ottenere un
polimorfismo di restrizione più dettagliato per ciascun lievito da analizzare.
Una volta rilevata la presenza/assenza dei singoli geni ADH, è possibile procedere alla conferma dei
risultati ottenuti sulla base dell’analisi del DNA mediante confronto con quelli ottenuti dallo studio delle
attività enzimatiche ADH codificate dai singoli geni.
Infatti, l’analisi degli zimogrammi ADH ottenuti nell’ambito del presente progetto per ciascun ceppo ha
permesso di confermare che:
a) l’assenza dell’amplificato di uno specifico gene è sempre associata alla mancanza del rispettivo
enzima, a conferma che i primers utilizzati sono altamente specifici per ciascun gene.
b) la presenza/assenza degli enzimi ADH in un determinato ceppo ben si correla con il polimorfismo
di restrizione del relativo DNA.
Riassumendo i risultati, l’analisi combinata DNA-enzima suggerisce che i ceppi di chevalieri e italicus
della collezione di Perugia mostrano la presenza di tutti i geni ADH e, pertanto, possono essere
considerati delle varietà di cerevisiae. Al contrario, i ceppi B1 e B2 (S.bayanus) e U2 (S.uvarum)
della stessa collezione risultano privi del gene ADH3. Inoltre, questi tre ceppi presentano un profilo
RFLP e uno zimogramma tra loro sovrapponibili ma molto diversi da quelli delle altre specie di lieviti
analizzati. Questi dati suggeriscono che B1, B2 e U2, classificati sulla base delle loro caratteristiche
fisio-morfologiche in specie diverse del genere Saccharomyces, possono invece appartenere alla stessa
variante di specie.
E’ interessante inoltre sottolineare che il pattern enzimatico del ceppo A-270 di uvarum della collezione
di Velletri, privo del gene ADH3, è sovrapponibile con quello dei ceppi B1, B2 e U2 della collezione di
Perugia.
Al contrario, il ceppo C-S6u uvarum della collezione di Velletri mostra uno zimogramma che somiglia
in parte a quello al ceppo A-270 uvarum e in parte a quello dei cerevisiae var. bayanus della stessa
collezione.
Questo dato conferma la capacità discriminante del nostro metodo dal momento che C-S6u, classificato
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