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MESSA A PUNTO DI UN NUOVO CRITERIO DI IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE<br />
AMPLIFICAZIONE DEL SISTEMA GENICO ADH<br />
Il metodo di screening genetico molecolare da noi utilizzato per discriminare i ceppi di lievito isolati<br />
dall’Istituto Sperimentale per l’Enologia di Velletri (ora CRA-Unità di ricerca per le produzioni<br />
enologiche dell’Italia centrale Velletri) si basa sull’analisi del sistema delle alcool deidrogenasi (ADH).<br />
Questo sistema è costituito da tre geni principali, chiamati ADH1, ADH2 e ADH3, che codificano per<br />
attività alcool deidrogenasiche coinvolte nel metabolismo dell’etanolo (Cyriacy 1975; 1979; Young<br />
e Pilgrim 1985). L’espressione dei geni che compongono il sistema delle alcool deidrogenasi viene<br />
regolata a livello trascrizionale, in funzione del tipo di fonte di carbonio disponibile per le cellule.<br />
In particolare i geni ADH1e ADH2 codificano rispettivamente per le proteine enzimatiche Adh1p e<br />
Adh2p, entrambe localizzate nel citoplasma. ADH1 viene espresso in modo semicostitutivo e viene<br />
indotto da glucosio. Il gene ADH2 codifica per un’attività responsabile dell’utilizzazione dell’etanolo<br />
accumulato durante la fermentazione e catalizza la conversione dell’etanolo ad acetaldeide, con<br />
concomitante riduzione del NAD + a NADH. L’espressione del gene ADH2 viene repressa in presenza di<br />
glucosio e indotta su fonti di carbonio respirabili, come etanolo e glicerolo.<br />
In S.cerevisiae esiste un terzo gene, ADH3, che codifica per un alcool deidrogenasi a localizzazione<br />
mitocondriale. La presenza di Adh3p aumenta di circa tre volte durante la crescita su glicerolo. L’isozima<br />
Adh3p partecipa ad un sistema navetta etanolo-acetaldeide capace di regolare l’equilibrio redox NAD + /<br />
NADH tra il citoplasma e il mitocondrio (Bakker et al., 2000).<br />
Esistono inoltre altri geni ADH, quali ADH5, che sembrano essere coinvolti nel metabolismo degli alcoli<br />
superiori (Dickinson et al., 2003).<br />
La scelta di questo sistema genico per il lavoro di caratterizzazione è stata effettuata principalmente per<br />
due motivi:<br />
- i geni ADH sono presenti in tutti i lieviti fermentativi in quanto necessari per la produzione di etanolo<br />
durante la vinificazione a partire dalle alte concentrazioni zuccherine presenti nei mosti;<br />
- i geni ADH mostrano tra loro un’alta omologia e potrebbero quindi costituire un buon substrato per<br />
analizzare le variazioni ceppo e/o specie dipendente nella sequenza del loro DNA .<br />
Nel nostro lavoro di caratterizzazione è stato analizzato il polimorfismo dei geni ADH1, ADH2,<br />
ADH3 e ADH5 mediante amplificazione per PCR utilizzando specifici DNA primers per ciascun gene.<br />
L’amplificazione dei geni ADH è stata condotta sia separatamente sui singoli geni (PCR) che utilizzando<br />
contemporaneamente le coppie di tutti i primers (vedi Tabella in Materiali e Metodi) relativi ai 4 geni<br />
nello stesso tubo di reazione (PCR-multiplex).<br />
Per ottenere un profilo più dettagliato del pattern dei DNA amplificati, questi sono stati sottoposti<br />
successivamente a digestione mediante Sau3AI, un enzima di restrizione che taglia con alta frequenza<br />
le molecole di DNA riconoscendo sequenze specifiche.<br />
Infine, abbiamo cercato di mettere in relazione l’assenza dell’amplificato dei singoli geni con la presenza/<br />
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