ГОСУДАРСТВЕННОЕ МЕДИЦИНСКОЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ

Ход работы: в две пробирки отмеряют по 0,5 мл раствора глутаминовой кислоты,
0,5 мл раствора ПВК, 1 мл раствора углекислого калия и 0,25 мл раствора
монобромуксусной кислоты.
В 1 пробирку (опыт) добавляют 0,5 мл свежей мышечной кашки, во вторую
пробирку - мышечную кашку, которая предварительно прокипячена на протяжении
1-2 минут. Обе пробирки ставят в термостат при t = 37 о С на 15 минут. Потом в каждую
добавляют по 0,25 мл уксусной кислоты и кипятят 2-3 минуты до полного осаждения
белков. Содержимое пробирок фильтруют.
Фильтраты хроматографируют. С этой целью на линии старта двух полосок
фильтровальной бумаги (опыт и контроль) наносят по капле фильтратов из пробирок,
каждый раз подсушивая на воздухе. Полоски бумаги опускают в пробирки, на дне
которых находится фенол, насыщенный водой. Пробирки в штативе помещают в
термостат на 1 час при 35-40 о С. После этого полоски бумаги вынимают, отмечают
линию фронта (финиш) растворителя, подсушивают 10-15 минут при 100 о С, а затем
проявляют раствором нингидрина. Снова подсушивают.
Для каждого определенного пятна вычисляют коэффициент Rf по формуле:
Rf = 1/h
где, 1- это расстояние от старта к центру пятна,
h- расстояние от старта к финишу ( расстояние, которое прошел
растворитель).
На основе полученных данных делают вывод, хроматограму подклевывают к
протоколу.
Rf аминокислот (для фенола):
Аспарагиновая к-та – 0,07 Аргинин – 0,41
Глутаминовая к-та – 0,16 Тирозин – 0,52
Цистеин – 0,19 Аланин – 0,55
Глицин (гликокол) – 0,30 Фенилаланин – 0,78
Метионин – 0,39 Лейцин – 0,79
2. Определение активности аминотрансфераз.
Принцип метода. Аминотрансферазы – ферменты которые содержат в качестве
коферментов фосфопиридоксамин, катализируют обратный перенос аминогрупп с
α-аминокислот на α-кетокислоты. Определение концентраци α-кетокислот, которые
образуются при трансаминирование лежит в основе динитрофенилгидразинового
метода определения активности трансаминаз.
Ход работы. Определение аспартатаминотрансферазы (АсАТ).
В пробирку вносят 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения АсАТ,
выдерживают в термостате при t =37 о С в течении 5 минут, добавляют 0,1 мл
сыворотки и инкубируют при t =37 о С 60 минут. Потом добавляют 0,5 мл раствора
динитрофенилгидразина и выдерживают в течении 20 минут при комнатной
температуре. Добавляют 5 мл 0,4 М раствору NaOH, перемешивают и оставляют на
10 минут.
Измеряют оптическую плотность проб, которая исследуются при λ = 560 нм.
Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). В пробирку вносят
0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения АлАТ, выдерживают в
термостате при t =37 о С в течении 5 минут, добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют
при t =37 о С 30 минут. Потом добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидрозина и
выдерживают в течении 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,4 М
раствору NaOH, перемешивают и оставляют на 10 минут. Измеряют оптическую
38