Патогенез ВИЧ-инфекции: 25 лет открытий и загадок ... - Tb-hiv.ru

Çîëåäðîíîâàÿ êèñëîòà è ÈË-2 óëó÷øàþò èììóíèòåò ó ÂÈ×-èíôèöèðîâàííûõ125Ðàçäåëåíèå êëåòîê è àíàëèç èõ ôóíêöèîíàëüíîéàêòèâíîñòèМКК выделяли с помощью центрифугирования в градиентеплотности (Ficoll-Hypaque; Pharmacia Biotech) икультивировали в среде RPMI 1640 с добавкой 10 % фетальнойтелячьей сыворотки, 2 ммоль/л L-глутамина и10 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина (EuroClone).У T-лимфоцитов и CD8 определяли образованиеинтерферона- (ИФН-) и наличие цитотоксическогофенотипа. Функции T-лимфоцитов исследовалис помощью стимуляции МКК ИПП (30 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США). Функции T-лимфоцитов CD8 оценивали,стимулируя МКК смесью 32 пептидов Gag ВИЧ,специфичных для T-лимфоцитов CD8 (AIDS Researchand Reference Reagent Program, National Institutes ofHealth, 1 мкг/мл каждого пептида), антител к CD28 иCD49d (1 мкг/мл каждого) (клоны CD28.2 и 9f10; BectonDickinson, США), как описано ранее. 28 МКК инкубировалив течение 16–18 ч при температуре 37 C в атмосфере,содержащей 5 % СО 2, в присутствии брефелдинаА (10 мкг/мл, Sigma, США), чтобы блокироватьэкзоцитоз белка. Стимуляцию индуцировали форболмиристатацетатом(50 нг/мл) (Serva Electrophoresis, Германия);в качестве положительного контроля использовалииономицин (1 мкг/мл) (Serva Electrophoresis).Èììóíîôåíîòèïèðîâàíèå è ìîíîêëîíàëüíûåàíòèòåëàЭкспрессию внутриклеточных и поверхностных маркеровоценивали с помощью проточной цитометрии. Использовалиследующие моноклональные антитела: кИФН-, меченные аллофитоцианином (АФЦ) (IgG1,клон B27), к CD107a, меченные флюоресцеина изотиоцианатом(ФИ) (IgG1k, клон H4A3), к V2 ФИ (IgG1k,клон B6), к CD27 PE (IgG1k, клон M-T271), к CD45RACy-chrome (IgG2b, клон HI100), к linage-1 ФИ (к CD3, кCD14, к CD16, к CD19, к CD20, к CD56), к HLA-DR Per-CP (IgG2a, клон L243), к CD80 PE (IgG1k, клон L307,4)и к CD11c АФЦ (IgG1k, клон B-ly6). Все антитела былиприобретены в Becton Dickinson в виде флюоресцентныхконъюгатов.Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ),содержащим 1 % альбумина бычьей сыворотки, и окрашивалимоноклональными антителами к мембраннымантигенам, описанными выше, в течение 15 мин притемпературе 4 C. Чтобы сделать клеточную мембранупроницаемой, после этого клетки в течение 10 мин фиксировалив ФСБ, содержащем 1 % формальдегида, инкубировалис моноклональными антителами к ИФН-,разведенными в ФСБ, содержащем 1 % альбумина бычьейсыворотки и 0,1 % сапонина, после чего повторносуспендировали в FacsFlow (Becton Dickinson). Мультипараметрическуюпроточную цитометрию проводили спомощью проточного цитометра FACSCalibur (BectonDickinson). Для анализа результатов использовано программноеобеспечение CellQuest (Becton Dickinson).Ñòàòèñòè÷åñêèé àíàëèçДля сравнения данных, полученных до обработки с зафиксированнымив разные моменты времени после нее,использовали непараметрический тест Уилкоксона длясогласованных пар. Статистически значимым считалиp < 0,05.ÐåçóëüòàòûÎáðàáîòêà in vitro ÌÊÊ, ïîëó÷åííûõ îòÂÈ×-èíôèöèðîâàííûõ, êîìáèíàöèåé ÇÊè ÈË-2, íî íå ÈË-2 â îòäåëüíîñòè, èíäóöèðóåòóâåëè÷åíèå ÷èñëà öèðêóëèðóþùèõT-ëèìôîöèòîâ , êîòîðûå ïðèíàäëåæàò ïðåèìóùåñòâåííîê ñóáïîïóëÿöèè êëåòîê öåíòðàëüíîéïàìÿòèВ небольшом предварительном исследовании in vitroсравнивалось действие ЗК и ИЛ-2 по отдельности и вкомбинации на циркулирующие T-лимфоциты V9V2от нелеченных пациентов с хронической стадией ВИЧинфекции.Как и ожидалось, обнаружено повышениечисла T-лимфоцитов V9V2, которое достигало пикачерез 2 нед. после обработки комбинацией ЗК и ИЛ-2(в среднем 32 % культивируемых МКК были V2+),что выше, чем после обработки только ЗК (10 %). Вто же время обработка только ИЛ-2 не оказывала никакогодействия (1,5 %), как и обработка питательнойсредой (1,4 %). Поскольку главной целью этого исследованиябыло изучение воздействия комбинаций,включавших ЗК, на T-лимфоциты , а ИЛ-2 не влиялна T-лимфоциты , необходимо было сравнить in vivoЗК + ИЛ-2 с ЗК.Ëå÷åíèå ÂÈ×-èíôèöèðîâàííûõ ÇÊ è ÈË-2èíäóöèðóåò ðàçìíîæåíèå öèðêóëèðóþùèõT-ëèìôîöèòîâ , ïðèíàäëåæàùèõ ïðåèìóùåñòâåííîê ñóáïîïóëÿöèÿì -êëåòîê öåíòðàëüíîéè ýôôåêòîðíîé ïàìÿòèТ-лимфоциты оценивали до лечения (t0) и на 3, 7, 14, 28и 56-й дни после него (t3, t7, t14, t28 и t56 соответственно).У больных, получавших ЗК + ИЛ-2, наблюдалосьвыраженное увеличение количества T-лимфоцитов к t7 (медиана t0 vs t7 — 6,17 vs 33,98; p = 0,002)(рис. 1, a). На 14-й день число T-лимфоцитов снизилось,но оставалось статистически значимо более высокимпо сравнению с исходным; то же отмечено и на28-й день (медиана t0 vs t14 — 6,17 vs 12,31, p = 0,020и медиана t28 — 9,89; p = 0,019). Через 56 дней числоT-лимфоцитов было близким к исходному. В контрольнойгруппе, в которой больные получали толькоЗК, изменений числа T-лимфоцитов не отмечено(рис. 1, b). Сходные результаты получены и после учетадоли V2-клеток (рис. 1, c и d).После этого мы задались вопросом: может ли лечениеЗК и ИЛ-2 повлиять на созревание T-лимфоцитов ?Для этого с помощью проточной цитометрии мы проанализировалиэкспрессию поверхностных маркеровCD27 и CD45RA, чтобы разделить девственные лимфоциты(CD27+CD45RA+), клетки центральной памяти(CD27+CD45RA–), клетки эффекторной памяти(CD27–CD45RA–) и окончательно дифференцированные(CD27–CD45RA+) T-лимфоциты . На рис. 2 показаноабсолютное число T-лимфоцитов , принадлежащихк различным популяциям: девственные лимфоциты,клетки центральной памяти, клетки эффекторной памятии окончательно дифференцированные клетки. Лечениекомбинацией ЗК и ИЛ-2 индуцировало рост числадевственных T-лимфоцитов , клеток центральнойи эффекторной памяти (рис. 2, a, c, e соответственно),но не влияло на окончательно дифференцирован-