Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

eingewogen und etwas Zellmateriall direkt von der Agarplatte hinzugegeben.
Anschließend wurden 350 µl der Lysis Solution Part A und 50 µl der Lysis Solution
Part B in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch invertiert. Die so
vorbereiteten Reaktionsgefäße wurden dann bei maximaler Geschwindigkeit eine
Minute horizontal geschüttelt. Nach dem Zellaufschluss wurden die Proben bei 65 °C
10 min auf einem Heizblock inkubiert. Zum Fällen der Proteine wurden 130 µl
Precipitation Solution zur Probe pipettiert, das Reaktionsgefäß gut geschüttelt und
dann fünf min auf Eis inkubiert. Der dabei entstandene Niederschlag wurde fünf min
in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur und 13.870 x g abzentrifugiert. Der
Überstand wurde abgenommen, zum Reinigen der DNA auf eine blaue
Filtrationssäule pipettiert und wiederholt für eine Minute bei 13.870 x g
abzentrifugiert. Alle weiteren Zentrifugationsschritte erfolgten ebenfalls bei
Raumtemperatur. Der Filter wurde verworfen und der Durchfluss zur weiteren
Verwendung auf Eis gelagert. Zur Vorbereitung der Bindungssäule wurden 500 µl
Column Preparation Solution auf die Säule geben und eine Minute bei 12.000 x g
zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend wurde das DNA
enthaltende Filtrat mit 700 µl Binding Solution versetzt, gut gemischt und zum Teil
(700 µl) auf die DNA-Bindungssäule übertragen. Das Gemisch wurde wiederum für
eine Minute zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Vorgang wurde
wiederholt, bis das gesamte Gemisch auf die Säule gegeben war. Zum Waschen der
an die Säule gebundenen DNA wurden 500 µl Wash Solution auf die Säule pipettiert
und eine Minute abzentrifugiert. Zum vollständigen Entfernen der Wash Solution
wurde dieser Schritt mit einer drei minütigen Zentrifugationszeit wiederholt. Für die
Elution der DNA aus dem Filter wurde die Bindungssäule auf ein neues
Reaktionsgefäß gesetzt. Die DNA wurde nun zweimal mit je 50 µl Elution Solution
(auf 65 °C vorgewärmt) durch jeweils einminütiges Zentrifugieren aus dem Filter
gelöst.
Bei jeder DNA-Extraktion wurde eine Negativkontrolle parallel aufgearbeitet. Hierzu
wurde das Lysing Matrix E Reaktionsgefäß bzw. das Reaktionsgefäß mit
Zirkoniumkugeln nur mit den zu Beginn eingesetzten Puffern (ohne Probe) in der
Schwingkugelmühle geschüttelt. Im weiteren Verlauf wurde die Kontrolle gleich
behandelt wie die Proben.
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