Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...
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2.4.5 Sequenzierung durch Kettenabbruchverfahren (Terminatorverfahren)<br />
Für die Sequenzierung der 16S rRNA-Gene der gewonnenen Isolate <strong>und</strong> der 16S<br />
rRNA-Gen-Inserts der Klon-Kolonien wurde die enzymatisch katalysierte Synthese<br />
nach Sanger et al. (1977) verwendet.<br />
Die Sequenzierung der 16S rRNA-Gene der gewonnenen Isolate <strong>und</strong> der 16S rRNA-<br />
Gen-Inserts der Klon-Kolonien wurde als Auftragsarbeit größtenteils vom<br />
Sequenzierungsservice, Services in Molecular Biology (Berlin) <strong>und</strong> teilweise vom<br />
Institut für Mikrobiologie <strong>und</strong> Molekularbiologie, JLU, Gießen durchgeführt.<br />
Zur Sequenzierung der 16S rRNA-Gen-Inserts der Klon-Kolonien wurden der M13<br />
reverse bzw. der M13 forward Primer in einer Konzentration von 10 pmol/µl<br />
eingesetzt.<br />
2.4.5.1 Auswertung der Sequenzen<br />
Die Rohdaten der Sequenzierung wurden in das Software Programm MEGA version<br />
4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, Tamura, Dudley, Nei, and Kumar 2007)<br />
eingelesen. Anhand einer BLAST ® -Suche (Basic Local Alignment Search Tool,<br />
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) in der primären Datenbank (Genebank) wurden<br />
die nächst verwandten Sequenzen <strong>und</strong> dazugehörigen Spezies (next blast relatives)<br />
ermittelt. Anschließend wurden die Vergleichssequenzen, welche von BLAST ® zu<br />
den unbekannten Sequenzen im Programm MEGA geladen wurden mit diesen<br />
„aligned“ <strong>und</strong> Korrektur gelesen.<br />
Im Anschluss an die Ermittlung der nächst verwandten Sequenzen zu den Isolaten<br />
bzw. Klonen mittels einer BLAST ® -Suche wurden weitere verwandte Spezies der<br />
entsprechenden Gattungen aus der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)<br />
heruntergeladen <strong>und</strong> gemeinsam mit der unbekannten Sequenz <strong>und</strong> dem<br />
spezifischen Actinomyceten-Primerpaar im Mega 4 Programm „aligned“ <strong>und</strong> einem<br />
Vergleich (im folgenden als „Phylogenetische“ Berechnung bzw. Baumberechnung<br />
bezeichnet) unterzogen. Als Methode <strong>zur</strong> Stammbaumberechnung wurde der<br />
„Neighbour-Joining“-Algorithmus verwendet. Für eine angemessene statistische<br />
Sicherheit wurden die Berechnungen 1000-mal nach der Bootstrap-Methode<br />
wiederholt.<br />
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