Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Raumtemperatur gelagert. Zur Dokumentation der Gelbilder wurden diese
eingescannt und als Datei gespeichert.
2.4.4 Klonierung
Über die Klonierung wurde in der hier vorliegenden Arbeit ein Gemisch
verschiedener, direkt aus Umweltproben gewonnener 16S rRNA-Gen Sequenzen
aufgetrennt, um im Anschluss daraus eine Klonbibliothek zu erhalten, die Aufschluss
über die vorhandenen Gattungen bzw. Spezies geben kann.
2.4.4.1 Durchführung der Klonierung
Um die transformierten E. coli Zellen zu kultivieren, wurde zunächst folgendes
Selektivmedium (LB-Amp-X-Gal-IPTG) hergestellt. Für 500 ml Medium wurden
folgende Komponenten in eine 1000 ml Schottflasche eingewogen:
Trypton 5,0 g
Hefeextrakt 2,5 g
NaCl 5,0 g
Agar 7,5 g
Reinstwasser 500 ml
Die Nährlösung wurde zuerst mit NaOH (2N) auf einen pH–Wert von 7,5 eingestellt,
dann wurde der Agar zugegeben und das Medium autoklaviert. Nachdem das
Medium auf ca. 50° C abgekühlt war, wurden 937,5 µl Ampicillin (50mg/ml), 0,8 ml X-
Gal (50 mg/ml) und 2,5 ml IPTG (100 mM) zugegeben. Anschließend wurde das
Medium in sterile Petrischalen gegossen. Diese wurden bis zur Verwendung bei 4° C
im Kühlraum gelagert.
Um die 16S rRNA-Gen-Abschnitte zu vervielfältigen, wurde die aus den
Umweltproben extrahierte DNA als Template in eine PCR mit spezifischen 16S rRNA
Primern in 4 x 25 µl Ansätzen eingesetzt (Abschnitt 2.4.2.1). In der vorliegenden
Arbeit wurde ein kommerziell erhältliches Klonierungskit (Promega p GEM-T ® Vector
Systems, Maison, USA) verwendet, das auf der Methode der T/A–Klonierung basiert.
Dieses beruht darauf, dass viele thermostabile DNA-Polymerasen die Fähigkeit
besitzen, an jedes 3´-Ende eines PCR–Fragmentes überhängende A-Nucleotide
anzufügen (3´-Adenylierungs-Aktivität). Anschließend lassen sich diese PCR–
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