Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

2.4.1.3 DNA-Extraktion aus Kolonien der abgeschwemmten Nähragarplatten
Die Analyse erfolgte modifiziert nach More et al., (1994). Zunächst wurden die mit
1,5 ml Natrium-Phosphatpuffer (120 mM, pH 8) aufgenommenen Bakterienkulturen
der abgeschwemmten Nährmedienplatten bei 13.870 x g bei Raumtemperatur
abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Für einen verbesserten Zellaufschluss
der Bakterien wurde ein einminütiger Aufschluss mit einer Schwingkugelmühle
durchgeführt. Dazu wurde ein Gramm steriler Zirkoniumkugeln (0,1 mm, Carl Roth
GmbH+Co, Karlsruhe) zu den Bakterienzellpellets eingewogen und 700 µl Natrium-
Phosphatpuffer, sowie 230 µl SDS (sodium dodecyl sulfate, 10%) hinzu pipettiert.
Anschließend wurden die Proben bei maximaler Geschwindigkeit eine Minute
horizontal geschüttelt. Nach einem fünfminütigen Zentrifugationsschritt bei 13870 x g
(4 °C) wurde der Überstand in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt.
Anschließend wurden 100 µl Lysozym (10 mg/ml, in Tris-EDTA-Puffer, pH 8) hinzu
gegeben und das Reaktionsgemisch invertiert. Das Gemisch wurde eine Stunde bei
37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 15 µl Proteinkinase K (20 mg/ml) dazu
pipettiert und das Gemisch 15 min bei 60 °C inkubiert. Die Lösung wurde
anschließend auf zwei Reaktionsgefäße aufgeteilt und mit dem 0,4 fachen Volumen
kalter Ammonium-Acetat-Lösung (7,5 M) versetzt, danach vorsichtig vermischt und
für sechs min auf Eis inkubiert. Der dabei entstandene Niederschlag wurde sechs
min bei 13.870 x g (4 °C) abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und in
ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die DNA-Fällung erfolgte über Nacht bei -20 °C
durch Zugabe des 0,7 fachen Volumens Isopropanol (99%, sterilfiltriert). Am
folgenden Tag wurde die DNA bei 13870 x g (4 °C) für 70 min abzentrifugiert.
Anschließend wurde das DNA-Pellet zweimal mit 70% igem kaltem Ethanol
gewaschen. Dazu wurden 600 µl Ethanol auf das DNA-Pellet pipettiert, gemischt,
anschließend bei 13.870 x g (4 °C) sechs min zentrifugiert und jeweils der Überstand
verworfen. Das DNA-Pellet wurde dann an der Luft getrocknet und abschließend in
50 µl TE-Puffer aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4 °C gelöst und die
zuvor geteilten Proben wieder vereinigt.
2.4.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction)
Die PCR als grundlegende molekularbiologische Methode diente der Bereitstellung
großer Mengen bestimmter DNA-Fragmente, für anschließende Sequenzierungs-,
Single-Strand-Conformation-Polymorphism-(SSCP)- und Klonierungsanalysen.
44