Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

2.4.3.1 Herstellen der einzelsträngigen DNA
Für den Vergleich der Diversität der Actinomycetenpopulation auf den verschiedenen
Nährmedien wurden zunächst die Kulturen von den unterschiedlichen
Nährmedienplatten (CM-Agar, Actinomyceten-Agar, BHI-Agar, Gauze-Agar und
Glycerin/Arginin-Agar) unterschiedlicher Verdünnungsstufen (10 0 -10 -3 )
abgeschwemmt. Dazu wurde jeweils steriler Natrium-Phosphatpuffer (1,5 ml) auf die
bewachsenen Agarplatten pipettiert und mit einer sterilen Einmalimpföse verteilt.
Anschließend wurden die Kolonien mit der Impföse von der Agarplatte gelöst und mit
einer Pipette in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Die DNA-Extraktion aus den
Mischkulturen erfolgte wie in Abschnitt 2.4.1.3 beschrieben.
Um eine hohe Produktmenge zu erhalten, wurde die PCR (Abschnitt 2.4.2) zur
Amplifikation des zu untersuchenden 16S rRNA-Gen Abschnittes (Primersystem:
Ac1886r-PH/ Com2xf) in einem zweifachen 50 µl Ansatz durchgeführt.
Die Aufreinigung des PCR-Produktes erfolgte unter Verwendung eines kommerziell
erhältlichen Aufreinigungskits (QiaQuick, PCR-Purification Kit, Qiagen, Hilden) und
wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Konzentration des
aufgereinigten PCR-Produktes wurde anschließend photometrisch bestimmt.
Um aus den doppelsträngigen DNA-Fragmenten Einzelstränge zu generieren, wurde
pro zu analysierender Probe ein entsprechendes Volumen (zwischen 300-1000 ng
DNA) des aufgereinigten PCR-Ansatzes mit 9 µl λ-Exonuclease-Puffer (Fermentas,
St. Leon Roth, 10x Konz.-Ansatzkonz: 1x) und 0,6 µl λ-Exonuclease versetzt. Dieser
Reaktionsansatz wurde bei 37 °C im Heizblock für eine Stunde inkubiert und
anschließend auf Eis gestellt. Die Aufreinigung der nun einzelsträngigen DNA
erfolgte mit Hilfe des QiaQuick PCR Purification Kit mit Mini Elutions Säulchen
(Quiagen, Hilden) weitestgehend nach Anleitung des Herstellers mit dem
Unterschied, dass die DNA am Ende der Aufreinigung mit 10 µl Tris-Puffer eluiert
wurde.
Um Hybridisierungen innerhalb oder zwischen den vorliegenden Einzelsträngen zu
lösen, wurde zu dem Eluat der einzelsträngigen DNA (~9 µl) ein gleiches Volumen an
formamidhaltigem SSCP-Ladepuffer (95 % Formamid, 10 mM NaOH,
Bromphenolblau, Xylene Xyonal) gegeben und durch auf- und abpipettieren
51