Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Probenmaterials sicher ausgeschlossen werden konnte. Ermittelt wurden diese
„Grenzkonzentrationen“ mittels Kontroll- bzw. Referenzproben des gleichen Materials
ohne mikrobielle Belastung.
Bei sog. „Umweltproben“ (Stäube, Luftfilter, Gipskarton etc.) wird erfahrungsgemäß
von 2000 mg/ml als Grenzkonzentration ausgegangen.
Die Materialextrakte wurden dann, wenn eine deutliche zytotoxische Wirkung vorlag,
jeweils um den Faktor 2 verdünnt, und zwar solange bis weniger als 50 % der Zellen
gehemmt wurden. Begonnen wurde mit der Verdünnung 1000 mg/ml gefolgt von 500
mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,50 mg/ml, 31,25 mg/ml. Höhere Verdünnungen
waren bei den Proben nicht erforderlich.
Bei der Untersuchung der Teststämme wurde die Plattenfläche als Bezugsbasis
gewählt, obwohl kein Flächenabstrich erfolgte, sondern der gesamten Agar
eingesetzt wurde. Diese Vereinfachung ist deshalb unproblematisch und ermöglicht
uneingeschränkt qualitative Vergleiche, da die Platten einheitlich mit dem gleichen
Agar in gleicher Schichtdicke von 5 mm gegossen worden sind.
Mit den Teststämmen wurde somit ausgehend von 62,5 cm²/ml entsprechend den
Materialproben verfahren, d.h. Verdünnung um jeweils den Faktor 2 (31,25 cm²/ml,
15,62 cm²/ml, 7,81 cm²/ml etc.) bis weniger als 50 % der Zellen gehemmt waren.
Die Belastung der Zielzellen mit den Probenverdünnungen erfolgt gleichzeitig mit der
Zelleinsaat, da die Testempfindlichkeit am höchsten ist, wenn die Probenextrakte
zusammen mit den Zellsuspensionen in die Platten gegeben werden.
Von den im Zellkulturmedium gelösten Probenaliquots wurden je 100 µl der
Verdünnungen mit Mehrkanalpipetten in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert.
Nach einer Inkubation von 48 h wurden 20 µl von dem in PBS (Phosphate-Buffered-
Saline) gelösten und sterilfiltrierten MTT-Farbreagenz (3-[4-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium-bromide)
zugegeben. Nach weiteren 4 h Inkubation wurde der
MTT-Umsatz als Maß der Zellschädigung gemessen.
Hierzu wurden eine photometrische Messung der in 100 µl DMSO gelösten violetten
Farbkristalle bei 510 nm durchgeführt (Hanelt et al., 1995).
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