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Blitzlicht Genomforschung
+CNA
+UPD
10% (8)
Normaler Karyotyp Anomaler Karyotyp
+CNA
+UPD
1% (1) -CNA
+UPD
5% (4)
-CNA
-UPD
27% (23)
-CNA +CNA
+UPD +UPD
1% (1) 1% (1)
deuten darauf hin, dass die Rearrangements
im Gegensatz zu zytogenetischen Befunden
nicht balanciert zu sein scheinen. Zudem wurde
ein Deletionsendpunkt identifiziert, der sich an
einer verbreiteten Translokations-Bruchstelle
im NUP98-Gen auf Chromosom 11p15 befand,
obgleich bei dem betroffenen Patienten keine
zytogenetischen Translokationen gefunden
worden waren. Kryptische Translokationen des
NUP98- und NSD1-Gens (5q35.3) wurden bereits
zuvor für AML beschrieben, diese können bei
zytogenetischen Untersuchungen übersehen
werden 16-17 . Daher screenten wir in der Probe
nach solchen Translokationen und fanden mittels
RT-PCR ein NUP98-NSD1-Fusionstranskript
der Exons 12 bzw. 6, aber nicht sein reziprokes
Gegenstück. Beim Screening zusätzlicher 179
AML-Proben fanden sich zwei weitere Proben
mit kryptischen Fusionstrans kripten.
Wiederauftretende CNA-Region in ALL-Genomen
enthalten oft mutierte Gene, die auch
in Proben ohne Veränderungen der Kopienzahl
verändert sind. Um zu überprüfen, ob dieses
Phänomen auch bei AML auftritt, wurde eine
fokale CNA auf Chromosom 12p12.3 untersucht,
die in drei AML-Patienten auftrat. Dieser Chromosomenbereich
enthält das ETV6-Gen, das
in AML-Patietenen oft mutiert und transloziert
vorliegt 19-20 . Tatsächlich enthielten drei von 180
Proben nicht-synonyme SNP-Varianten des
Gens (P4A, R105Q, and R202Q) in Abwesenheit
einer CNA. Die Analyse gesunder Haut-DNA,
für die allerdings nur Probenmaterial eines
Patienten zur Verfügung stand, bestätigte, dass
R105Q eine erworbene, zuvor nicht beschriebene
Mutation ist.
+CNA
-UPD
22% (19)
-CNA
-UPD
23% (20)
Partielle uniparentale Disomie
+CNA
-UPD
10% (9)
Abb. 2: Genetische Veränderungen in AML-Genomen. Die Grafik (aus [1]) zeigt den relativen
Anteil von AML-Proben mit anomalem (rot, n=20) und normalem (weiß, n=36) Karyotyp
mit (+) sowie ohne (–) CNAs und UPDs, Details siehe Text.
Mit Hilfe unabhängig voneinander, an unterschiedlichen
Stellen vom selben Patienten
entnommener (paarweiser) normaler und
Tumor-DNA konnten in Tumor-Proben mit
SNP-LOH (loss of heterogosity – eine Allel-
Imbalance, die auf den Verlust eines der Allele
oder die erhöhte Kopienzahl eines der Allele
zurückgeht) identifiziert werden. Ein LOH in
Abwesenheit einer CNA entspricht dabei einer
UPD. Es wurden in sieben der untersuchten
86 Proben acht UPD-Regionen identifiziert.
Diese traten gehäuft in zytogenetisch normalen
AML-Genomen auf (15% vs. 3.8%). Alle
UPD-Regionen dehnten sich bis zum Ende des
betroffenen Genoms aus und variierten in der
Größe (11-95 Mb).
Fazit
Zusammengenommen zeigen die ermittelten
Ergebnisse, dass AML-Genome – zumindest
bei der hier erzielten Auflösung von 35K – nicht
inherent instabil zu sein scheinen. Auch zeigte
sich eine bemerkenswerte Heterogenität der
in jedem AML-Genom mutierten Gene, wobei
in dieser Studie nicht die für die Pathogenese
ebenfalls potentiell relevante DNA-Methylierung
erfasst wurde. Da sich in den meisten
der untersuchten AML-Genome nur eine
geringe Zahl erworbener CNAs zeigte, steht
zu vermuten, dass mutierte Gene in diesen
Regionen eine wichtige Rolle bei der AML-
Pathogenese spielen. Die in sehr kleinen CNAs
auftretenden Gene wie etwa STAG2, PRMT2,
USP10 oder C8orf4 eignen sich hervorragend,
um diese Arbeitshypothese zu überprüfen.
Denn bisher wurde keines dieser mittels des
hier vorgestellten Genom-weiten hochaufgelösten
Genom-Screening identifizierten Gene
mit der AML-Pathogenese in Zusammenhang
gebracht. AML-Genome die in Folgestudien
mit der hier präsentierten Identifizierungs/
Validierungsstrategie untersucht werden,
dürften zur Etablierung eines umfassenden
Kataloges von Genkandidaten führen, die potentiell
zur AML-Pathogenese beitragen.
Obgleich in der vorliegenden Studie zahlreiche
in anderen Studien 6, 8, 10-12 entdeckte große
CNA-Regionen bestätigt werden konnten,
gibt es auch zahlreiche Diskrepanzen, die
sich im Wesentlichen auf drei grundlegende
Unterschiede im experimentellen Design
zurückführen lassen. Erstens, der eingesetzte
SNP-Array hat eine vier- bis zehnfach höhere
Auflösung als die in früheren Studien eingesetzten
Plattformen. Es wurden durchgehend
paarweise Tumor- und Kontrollproben desselben
Patienten eingesetzt. Drittens: Alle identifizierten
kleinen CNAs, die naturgemäß eine
außerordentlich hohe Rate an Falsch-positiven
aufweisen, wurden mit einer unabhängigen,
orthogonalen Plattform (RocheNimbleGen)
validiert. Dies erlaubte es eindeutig die erworbenen
somatischen CNA und UPD-Regionen
in AML-Genomen von erblichen CMVs zu unterscheiden,
was zuvor ohne Validierung und
Einsatz paarweiser Proben nicht möglich war.
CNAs und UPD sind danach – im Gegensatz
zu früher publizierten Ergebnissen – bei der
AML nicht so häufig wie bei ALL, ein starkes
Argument, noch höherauflösende genomische
Studien durchzuführen, um die an der
AML-Pathogenese beteiligten Genmutationen
systematisch zu katalogisieren und funktionell
zu charakterisieren. Dafür empfiehlt sich
eine Kombination existierender Plattformen
wie die traditionelle Zytogenetik mit FISH,
SNP-Arrays, Array-CGH und gezielten Next-
Generation-Sequencing-Verfahren.
Literatur
[1] Walter MJ, Payton JE, Ries RE, Shannon WD, Deshmukh H,
Zhao Y, Baty J, Heath S, Westervelt P, Watson MA, Tomasson
MH, Nagarajan R, O‘Gara BP, Bloomfield CD, Mrózek K, Selzer
RR, Richmond TA, Kitzman J, Geoghegan J, Eis PS, Maupin R,
Fulton RS, McLellan M, Wilson RK, Mardis ER, Link DC, Graubert
TA, DiPersio JF, Ley TJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug
4;106(31):12950-5
Eine umfassende Literaturliste kann beim Autor angefordert werden
Korrespondenzadresse
Dr. Burkhard Ziebolz
Roche Applied Science
82377 Penzberg
burkhard.ziebolz@roche.com
10 | 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 LABORWElT