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Blitzlicht DNA-Methylierung Hierbei kann die Menge des Startmaterials stark schwanken. Studien haben gezeigt, dass sich in einem Milliliter Plasma zwischen 4 ng und 750 ng frei zirkulierender humaner genomischer DNA befinden kann 2 . Nach der DNA-Isolierung wird die zu untersuchende DNA-Region mit Hilfe einer konventionellen PCR amplifiziert. Dieser Schritt ermöglicht die Anreicherung der DNA-Moleküle und zugleich die Einführung von universellen Tag- Sequenzen, welche die weiteren Arbeitsschritte vereinfachen. Emulsions-PCR: Die DNA der Präamplifikation wird verdünnt und dient als Ausgangsmaterial für die Emulsions-PCR. Der PCR-Ansatz enthält die Komponenten einer konventionellen PCR (z.B. Nukleotide, Polymerase), ein spezielles Öl-Emulgator-Gemisch sowie magnetische A B Mikropartikel, an die ebenfalls universelle Tag-Sequenzen gekoppelt sind. Die wässrige Phase wird mit dem Öl emulgiert, so dass Millionen einzelner Wassertröpfchen mit einem Durchmesser von 3µm bis 10 µm einen Reaktionsraum für separate PCR-Reaktionen bilden (Abb. 1 B). In den Wassertröpfchen befindet sich statistisch nur ein einzelnes DNA-Molekül und ein magnetisches Partikel. Während der Reaktion werden die einzelnen DNA-Moleküle in den Tropfen auf der Partikeloberfläche mit Hilfe der gekoppelten Tag-Sequenzen vervielfältigt (Abb. 1 C). Hybridisierung: Nach der PCR wird die Wasser- und Ölphase wieder getrennt, so dass sich die Mikropartikel in der wässrigen Phase befinden. Mit Hilfe einer sequenzspezifischen Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Abb. 1: A: Schematische Darstellung der BEAMing-Technologie. B: Lichtmikroskopische Aufnahme von Wasser-in-Öl-Emulsionen mit magnetischen Mikropartikeln (Durchmesser 1 µm) C: Schematische Darstellung der DNA-Amplifikation auf der Oberfläche eines magnetischen Mircopartikels D: Durchflusszytometer-Diagramm einer Patientenprobe mit Mutationen (rote Partikel) C D DNA-Sonden wird die auf dem Mikropartikel gebundene DNA markiert. Das Ergebnis der Hybridisierung sind Partikel, die – je nach Mutationsstatus – mit einem der beiden Farbstoffe markiert sind. Die Analyse der Mikropartikel erfolgt mit einem Durchflusszytometer, das mehrere tausend Partikel pro Sekunde quantifizieren kann (Abb. 1 D). Die Anzahl der gemessenen Partikel entspricht somit der Häufigkeit der Wildtyp- und Tumor-DNA in der Plasmaprobe. Da Tumore je nach Stadium und Ursprungsorgan ein spezielles Mutationsspektrum aufweisen, ist die Entwicklung verschiedener Plasmatests erforderlich. Für häufig mutierte Gene, wie PIK3CA, BRAF, KRAS, TP53 und APC stehen bereits BEAMing-Assays zur Verfügung. Die offene Architektur der BEAMing-Technologie ermöglicht eine schnelle Etablierung weiterer Mutations- und Methylierungstests. Anwendung der BEAMing-Technologie in der Onkologie Die sensitive Detektion somatischer Mutationen in Blutplasma und anderem klinischen Probenmaterial mit der BEAMing-Technologie kann zur Entwicklung neuartiger in vitro- Diagnostika in der Onkologie genutzt werden. Schwerpunktmäßig könnten Bluttests im Bereich der Versorgung von Krebspatienten nach erfolgter Diagnose eingesetzt werden. Dabei lassen sich verschiedene klinische Anwendungsgebiete unterscheiden (Abb. 2). Therapieauswahl Es ist bekannt, dass zielgerichtete molekulare Krebstherapeutika nur in relativ kleinen Patientengruppen effizient wirken. Die Schwierigkeit bei der routinemäßigen Verwendung und Entwicklung dieser Medikamente ist deshalb, die geeigneten Patientenpopulationen vorab auszuwählen. Für einige Krebsarten wurden bereits bestimmte DNA-Mutationen entdeckt, die zur Patientenauswahl dienen. So sind therapeutische Antikörper wie Erbitux® oder Vectibix® nur wirksam bei Patienten mit dem KRAS-Wildtyp-Gen. In der Praxis ist ein solcher Nachweis für einen Teil der Patienten schwierig, da der Mutationsnachweis bis vor kurzem nur an Tumorgewebe selbst durchgeführt werden konnte, die Gewinnung des Tumorgewebes durch Biopsie oder operativen Eingriff aber mit Risiken und erheblichen Kosten verbunden ist. Ein prädiktiver Bluttest eröffnet hier eine bessere Patientenversorgung. Therapieverlauf Im Verlauf einer Behandlung könnte mit BEAMing auch bestimmt werden, ob eine Therapie erfolgreich ist, ob also die Tumorzellen durch 24 | 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 LABORWElT
Abb.2: Anwendungsgebiete der BEAMing-Technologie in der Onkologie: Therapieauswahl, Therapieverlauf und Nachsorge das Medikament selektiv absterben. Diese Erkenntnisse würden – falls erforderlich – einen schnelleren Therapiewechsel ermöglichen oder die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden beschleunigen. In einer Studie mit 18 Darmkrebspatienten konnte bereits gezeigt werden, dass die Menge der Tumor-DNA im Blut mit der Größe und Invasivität des Tumors korreliert 4 . In diesen Patienten lag die Anzahl deer mutierten DNA-Moleküle zwischen 1 und 1833 (Median 39). Dies bildet den Ausgangspunkt für weitere Studien, um den Nutzen dieser Art von Plasmadiagnostik zu evaluieren. Nachsorge Ziel der Krebs-Nachsorgeuntersuchungen ist es, einen wiederauftretenden Tumor möglichst früh zu erkennen, so dass therapeutisch eingegriffen werden kann. Mit der BEAMing- Technologie könnten im Rahmen der Nachsorge nicht entfernter Resttumor oder kleinste wiederkehrende Metastasen nachgewiesen werden. In Patienten mit metastasiertem Kolonkarzinom konnte dies bereits gezeigt werden 4 . So konnte wenige Wochen nach einer Behandlung in 15 von 16 Fällen (94%) ein Wiederauftreten der Tumorerkrankung vorhergesagt werden. Denkbar ist ebenfalls, dass BEAMing in der Früherkennung über eine regelmäßige Blutabnahme Krebserkrankungen schon vor dem Auftreten klinischer Symptome detektiert. Diese frühen Tumore könnten dann durch einen operativen Eingriff entfernt werden. Neben der Blutplasmadiagnostik ist – beispielsweise beim Kolonkarzinom – auch die Anwendung von BEAMing auf Stuhlproben möglich 5,6 . Abschließend lässt sich sagen, dass BEAMing neue Wege in der Krebsdiagnostik eröffnet. Es ist eine nicht-invasive Detektion von Tumoren unterschiedlicher Organe über das Blutplasma möglich. Des Weiteren eignet sich das Verfahren zur begleitenden Diagnostik bei Krebstherapien, da die Wirksamkeit von Therapieansätzen schnell abgeschätzt, und die Therapie gegebenenfalls angepasst werden kann. All diese Ansätze verfolgen das Ziel, die Krebsbehandlung effektiver und kostengünstiger zu machen, so dass die Mortalitätsrate in Zukunft gesenkt werden kann. Literatur [1] Coleman M.P., Alexe D.M., Albreht T., McKee, M., Institute of Public Health of the Republic of Slovenia (2008) www.euro.who.int/Document/E91137.pdf [2] Diehl F., Li M., Dressman D., He Y., Shen D., Szabo S., Diaz L.A. Jr, Goodman S.N., David K.A., Juhl H., Kinzler K.W., Vogelstein B., PNAS 102 (2005), 16368-16373. [3] Dressman D., Yan H., Traverso G., Kinzler K.W., Vogelstein B., PNAS 100 (2003), 8817-8822. [4] Diehl F., Schmidt K., Choti M.A., Romans K., Goodman S., Li M., Thornton K., Agrawal N., Sokoll L., Szabo S.A., Kinzler K.W., Vogelstein B., Diaz L.A. Jr., Nature Medicine 14 (2008), 985-990. [5] Li M., Chen W.D., Papadopoulos N., Goodman S.N., Bjerregaard N.C., Laurberg S., Levin B., Juhl H., Arber N., Moinova H., Durkee K., Schmidt K., He Y., Diehl F., Velculescu V.E., Zhou S., Diaz L.A. Jr, Kinzler K.W., Markowitz S.D., Vogelstein B., Nature Biotechnology (2009) 21, 858-863 [6] Diehl F., Schmidt K., Durkee K.H., Moore K.J., Goodman S.N., Shuber A.P., Kinzler K.W., Vogelstein B. Gastroenterology 135 (2008), 489-498. Korrespondenzadresse Next generation sequencing applying the Roche GS FLX TITANIUM Technology Dr. Frank Diehl Inostics GmbH Falkenried 88 AGOWA genomics www.laborwelt.de 20251 Hamburg Tel.: +49-(0)40-41 33 83 90 Fax: +49-(0)40-41 33 83 94 diehl@inostics.com AGOWA GmbH (part of LGC) Tel: +49 (0)30 5304 2260 Email: ngs@agowa.de Web: www.lgc.co.uk/genomics LABORWElT No part of this publication may be reproduced or transmitted 10. in any Jahrgang form or by any means, | Nr. electronic 5/2009 or mechanical, | 25 including photocopy- 035/1.09-2009-08 Service features: • De novo sequencing of genomes • Finishing of de novo sequencing • Analysis of: - metagenomes - transcriptomes / normalised cDNA - methylation patterns - pools of tagged fosmids and BACs • Targeted re-sequencing • ChIP and ncRNA sequencing • Sequence enrichment Visit us at BIOTECHNICA 2009 at booth F19 in hall 9. ing, recording or any retrieval system, without the written permission of the copyright holder. © LGC Limited, 2009. All rights reserved. Picture: Museum Wiesbaden and Kevin Clarke, The Invisible Body, Wiesbaden 1999 (Portrait of Miguel Algarin, page 28)
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