Blitzlicht Genomforschung +CNA +UPD 10% (8) Normaler Karyotyp Anomaler Karyotyp +CNA +UPD 1% (1) -CNA +UPD 5% (4) -CNA -UPD 27% (23) -CNA +CNA +UPD +UPD 1% (1) 1% (1) deuten darauf hin, dass die Rearrangements im Gegensatz zu zytogenetischen Befunden nicht balanciert zu sein scheinen. Zudem wurde ein Deletionsendpunkt identifiziert, der sich an einer verbreiteten Translokations-Bruchstelle im NUP98-Gen auf Chromosom 11p15 befand, obgleich bei dem betroffenen Patienten keine zytogenetischen Translokationen gefunden worden waren. Kryptische Translokationen des NUP98- und NSD1-Gens (5q35.3) wurden bereits zuvor für AML beschrieben, diese können bei zytogenetischen Untersuchungen übersehen werden 16-17 . Daher screenten wir in der Probe nach solchen Translokationen und fanden mittels RT-PCR ein NUP98-NSD1-Fusionstranskript der Exons 12 bzw. 6, aber nicht sein reziprokes Gegenstück. Beim Screening zusätzlicher 179 AML-Proben fanden sich zwei weitere Proben mit kryptischen Fusionstrans kripten. Wiederauftretende CNA-Region in ALL-Genomen enthalten oft mutierte Gene, die auch in Proben ohne Veränderungen der Kopienzahl verändert sind. Um zu überprüfen, ob dieses Phänomen auch bei AML auftritt, wurde eine fokale CNA auf Chromosom 12p12.3 untersucht, die in drei AML-Patienten auftrat. Dieser Chromosomenbereich enthält das ETV6-Gen, das in AML-Patietenen oft mutiert und transloziert vorliegt 19-20 . Tatsächlich enthielten drei von 180 Proben nicht-synonyme SNP-Varianten des Gens (P4A, R105Q, and R202Q) in Abwesenheit einer CNA. Die Analyse gesunder Haut-DNA, für die allerdings nur Probenmaterial eines Patienten zur Verfügung stand, bestätigte, dass R105Q eine erworbene, zuvor nicht beschriebene Mutation ist. +CNA -UPD 22% (19) -CNA -UPD 23% (20) Partielle uniparentale Disomie +CNA -UPD 10% (9) Abb. 2: Genetische Veränderungen in AML-Genomen. Die Grafik (aus [1]) zeigt den relativen Anteil von AML-Proben mit anomalem (rot, n=20) und normalem (weiß, n=36) Karyotyp mit (+) sowie ohne (–) CNAs und UPDs, Details siehe Text. Mit Hilfe unabhängig voneinander, an unterschiedlichen Stellen vom selben Patienten entnommener (paarweiser) normaler und Tumor-DNA konnten in Tumor-Proben mit SNP-LOH (loss of heterogosity – eine Allel- Imbalance, die auf den Verlust eines der Allele oder die erhöhte Kopienzahl eines der Allele zurückgeht) identifiziert werden. Ein LOH in Abwesenheit einer CNA entspricht dabei einer UPD. Es wurden in sieben der untersuchten 86 Proben acht UPD-Regionen identifiziert. Diese traten gehäuft in zytogenetisch normalen AML-Genomen auf (15% vs. 3.8%). Alle UPD-Regionen dehnten sich bis zum Ende des betroffenen Genoms aus und variierten in der Größe (11-95 Mb). Fazit Zusammengenommen zeigen die ermittelten Ergebnisse, dass AML-Genome – zumindest bei der hier erzielten Auflösung von 35K – nicht inherent instabil zu sein scheinen. Auch zeigte sich eine bemerkenswerte Heterogenität der in jedem AML-Genom mutierten Gene, wobei in dieser Studie nicht die für die Pathogenese ebenfalls potentiell relevante DNA-Methylierung erfasst wurde. Da sich in den meisten der untersuchten AML-Genome nur eine geringe Zahl erworbener CNAs zeigte, steht zu vermuten, dass mutierte Gene in diesen Regionen eine wichtige Rolle bei der AML- Pathogenese spielen. Die in sehr kleinen CNAs auftretenden Gene wie etwa STAG2, PRMT2, USP10 oder C8orf4 eignen sich hervorragend, um diese Arbeitshypothese zu überprüfen. Denn bisher wurde keines dieser mittels des hier vorgestellten Genom-weiten hochaufgelösten Genom-Screening identifizierten Gene mit der AML-Pathogenese in Zusammenhang gebracht. AML-Genome die in Folgestudien mit der hier präsentierten Identifizierungs/ Validierungsstrategie untersucht werden, dürften zur Etablierung eines umfassenden Kataloges von Genkandidaten führen, die potentiell zur AML-Pathogenese beitragen. Obgleich in der vorliegenden Studie zahlreiche in anderen Studien 6, 8, 10-12 entdeckte große CNA-Regionen bestätigt werden konnten, gibt es auch zahlreiche Diskrepanzen, die sich im Wesentlichen auf drei grundlegende Unterschiede im experimentellen Design zurückführen lassen. Erstens, der eingesetzte SNP-Array hat eine vier- bis zehnfach höhere Auflösung als die in früheren Studien eingesetzten Plattformen. Es wurden durchgehend paarweise Tumor- und Kontrollproben desselben Patienten eingesetzt. Drittens: Alle identifizierten kleinen CNAs, die naturgemäß eine außerordentlich hohe Rate an Falsch-positiven aufweisen, wurden mit einer unabhängigen, orthogonalen Plattform (RocheNimbleGen) validiert. Dies erlaubte es eindeutig die erworbenen somatischen CNA und UPD-Regionen in AML-Genomen von erblichen CMVs zu unterscheiden, was zuvor ohne Validierung und Einsatz paarweiser Proben nicht möglich war. CNAs und UPD sind danach – im Gegensatz zu früher publizierten Ergebnissen – bei der AML nicht so häufig wie bei ALL, ein starkes Argument, noch höherauflösende genomische Studien durchzuführen, um die an der AML-Pathogenese beteiligten Genmutationen systematisch zu katalogisieren und funktionell zu charakterisieren. Dafür empfiehlt sich eine Kombination existierender Plattformen wie die traditionelle Zytogenetik mit FISH, SNP-Arrays, Array-CGH und gezielten Next- Generation-Sequencing-Verfahren. Literatur [1] Walter MJ, Payton JE, Ries RE, Shannon WD, Deshmukh H, Zhao Y, Baty J, Heath S, Westervelt P, Watson MA, Tomasson MH, Nagarajan R, O‘Gara BP, Bloomfield CD, Mrózek K, Selzer RR, Richmond TA, Kitzman J, Geoghegan J, Eis PS, Maupin R, Fulton RS, McLellan M, Wilson RK, Mardis ER, Link DC, Graubert TA, DiPersio JF, Ley TJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 4;106(31):12950-5 Eine umfassende Literaturliste kann beim Autor angefordert werden Korrespondenzadresse Dr. Burkhard Ziebolz Roche Applied Science 82377 Penzberg burkhard.ziebolz@roche.com 10 | 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 LABORWElT
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