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Blitzlicht Microarrays Lysat-Spot Zielprotein spezifischer 1. Antikörper Nitrocellulose-beschichtete Objektträger mit jeweils zwei Subarrays Abb. 2: Prinzip der Reverse Phase Protein-Arrays (RPPA). Jeder Subarray kann mit einem anderen Antikörper ausgelesen werden. Auf diese Weise werden über viele Proben hinweg Expressionsprofile für ausgewählte Proteine erstellt, die anschließend mit Hilfe von bioinformatischen Verfahren miteinander verglichen werden können. Proben können mit Hilfe von Antikörpern Zielproteine spezifisch erkannt und markiert werden. Anschließend werden die an die Zielproteine gebundenen Antikörper mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern und geeigneten Scannern sichtbar gemacht. Die Intensität des Fluoreszenzsignals entspricht dabei über einen sehr großen Bereich der Menge des Zielproteins auf dem Array. Mit Hilfe moderner Methoden der Datenanalyse und der Statistik lassen sich die Signale aller Proben auf den unterschiedlichen Slides NIR-markierter 2. Antikörper Scan eines Objektträgers analysieren und vergleichen 4,5 . Die Stärke der RPPA-Technologie liegt darin, die Expression einer Vielzahl von Proteinen und Phosphoproteinen in verschiedenen Proben mit hoher Sensitivität und nur minimalem Probenbedarf miteinander vergleichen zu können. Von jeder Probe wird pro Slide ein Volumen von wenigen Nanolitern benötigt. In einem Tropfen von einem Nanoliter ist bereits das gesamte Proteom einer Zelle präsentiert. Da die Sensitivität des RPPA-Ansatzes im picomolaren Bereich liegt, lassen sich auch gering exprimierte Abb. 4: Prinzip Microspot-Immunoassay (MIA). Spezifische Fängerantikörper werden als Replikatspots in 16 identischen Subarrays auf den Träger gedruckt. Jeder Fängerantikörper erkennt sein Zielprotein. Ein zweites Epitop jedes Zielproteins wird nach Inkubation mit einem Cocktail aus spezifischen Detektionsantikörpern markiert und kann in einem weiteren Inkubationsschritt fluoreszenzmarkiert visualisiert werden. Mit Hilfe von geeigneten Standards können die Fluoreszenzsignale der Proben quantitativ analysiert werden. Dieser Ansatz ist insbesondere für quantitative Phosphoproteomics geeignet. Proteine und Phosphoproteine zuverlässig detektieren. Dank dieser hohen Sensitivität der RPPA-Technik können auch klinische Proben analysiert werden 6,7 , und die Motivation zur Etablierung der RPPA Strategie zielte ursprünglich darauf ab, die Limitationen etablierter Proteomanalyse-Methoden zu überwinden und eine adäquate Methode für quantitative Analysen von Proteinnetzwerken in klinischen Proben zu entwickeln 8 . Nicht zuletzt haben sich RPPA auch als hilfreiches Werkzeug für die Quantifizierung von Proteinen und Phosphoproteinen nach siRNA-basierten Knock-downs erwiesen 9,10 . Auch systembiologische Untersuchungen wie etwa die Analyse von zeitaufgelösten Messungen können mit Hilfe von RPPA effizient durchgeführt werden 11 . Bindet beispielsweise EGF an seinen Rezeptor EGFR, werden vielfältige Phosphorylierungsprozesse initiiert. Obwohl der EGFR in verschiedenen Zelllinien prinzipiell dieselben Signalwege nutzt, zeigt jede Zelllinie ihre ganz charakteristische Dynamik. Dies ist zunächst 1 0 10 20 30 40 50 60 Abb. 3: EGF-induzierte Phosphorylierung der Proteinkinasen ERK in den humanen Brustkrebszelllinien HCC-1954, BT-474 und MCF-7 30 | 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 LABORWElT pERK phosphorylation 2 1.5 BT474 HCC1954 MCF7 time [min] überraschend, da sich die Expression des EGFR in den untersuchten Zelllinien nicht grundlegend unterscheidet. Trotzdem induziert EGF in den humanen Brustkrebszelllinien MCF-7 und BT-474 nur eine zeitlich begrenzte Phosphorylierung der Proteinkinase ERK1/2. In der humanen Brustkrebszelllinien HCC- 1954 verläuft die Dynamik anders, und die Aktivierung der Proteinkinase ERK1/2 ist nach einer Stunde noch nicht wieder abgeklungen (Abb. 3). Offensichtlich ist nicht nur das bloße Vorhandensein des Rezeptors für die Dynamik der untergeordneten Prozesse verantwortlich, sondern auch das Repertoire an Dimerisierungspartnern oder intrazellulären Proteinen, die gemeinsam in die Signaltransduktion eingebunden sind. Microspot-Immunoassay Im Gegensatz zu den RPPA werden beim Microspot-Immunoassay (MIA) Fängermoleküle, beispielsweise Antikörper, auf den
CO 2 - Abfall oder Rohstoff? Möglichkeiten und Grenzen der CO2-Sequestrierung 3.-4.11.2009, Zentrum für Umweltkommunikation, Osnabrück Im Rahmen dieser zweitägigen Konferenz zum Thema Abscheidung von CO soll unter technologischen, ökolo- 2 gischen und wirtschaftlichen Aspekten diskutiert werden, ob CO als Industrieabfall entsorgt oder als Rohstoff 2 zum Aufbau komplexer Kohlenstoffverbindungen genutzt werden kann. Dazu werden erste Ergebnisse der angewandten CO -Abscheidungs-, Transport- und Lagerungstechnologien verschiedener deutscher Pilotanla- 2 gen vorgestellt sowie Möglichkeiten der biologisch-chemischen Fixierung und Nutzung von CO aus aktuellen 2 Forschungsprojekten in Deutschland aufgezeigt. Unter anderem werden als Referenten sprechen Prof. Dr. Hartmut Graßl, Max-Planck-Institut für Meteorologie, Meteorologisches Institut der Universität Hamburg Prof. Dr. Manfred Fischedick, Vizepräsident, Wuppertal Institut für Klima, Umwelt, Energie Dr. Thomas Haas, Leiter Science-to-Business Center Biotechnologie, Creavis Technologies & Innovation, Evonik Degussa GmbH Prof. Dr. Walter Leitner, Leiter Institut für Technische Chemie und Makromolekulare Chemie, RWTH Aachen Dr. Wolfgang Rolland, Leiter Bergwirtschaft/Bergbaustrategie, Vattenfall Europe Mining AG Prof. Dr. Walter Trösch, Abteilungsleiter Umweltbiotechnologie und Bioverfahrenstechnik, Fraunhofer IGB Dr. Hilke Würdemann, Leiterin Bio-Geoengineering, Deutsches GeoForschungszentrum Registrierung und weitere Informationen unter www.biocom.de/events. Medienpartner: zertifiziert durch: BIOCOM Projektmanagement GmbH | Brunnenstraße 128 | 13355 Berlin | Germany www.biocom.de | events@biocom.de | Tel. +49 (0)30 264921-53 | Fax +49 (0)30 264921-66
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