PDF Download - Laborwelt

Protein-Microarrays:
Sensitive quantitative
Analyse von Signalwegen
Frauke Henjes, Frank Götschel, Heiko Mannsperger, Johanna Sonntag, Ulrike Korf;
Molekulare Genomanalyse, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Proteinen kommt bei der Identifizierung von neuen Krankheitsmarkern und bei der Entwicklung
gezielter Therapien eine besondere Bedeutung zu, da sie die Funktionsträger der
Zelle sind. Von Seiten der klinischen Forschung sowie der Systembiologie besteht daher
ein großer Bedarf an zuverlässigen quantitativen Daten, die in vielen Proben gleichzeitig
erhoben werden können. Diesem Anspruch kommen die charakteristischen Merkmale von
Protein-Microarray-Technologien, wie hohe Probenkapazität und hohe Sensitivität, entgegen.
Protein-Microarrays liefern als Antikörper-basiertes Verfahren zuverlässige Daten für
gezielte Fragestellungen und sind daher sowohl für die zielgerichtete klinische Forschung
wie auch die systematische Analyse von Signalwegen eine vielversprechende experimentelle
Plattform. In jüngerer Zeit haben sich Protein-Microarrays insbesondere bei der Erforschung
von krebsrelevanten Signalwegen bewährt.
Abb. 1: Wachstumsfaktor-vermittelte Signaltransduktion. Gezeigt werden EGFR und sein Ligand
EGF, ERBB3 und sein Ligand HRG sowie der ligandenunabhängig agierende Rezeptor
ERBB2. Diese Rezeptoren müssen miteinander dimerisieren, um nachgeordnete Signaltransduktionswege
zu aktivieren. Funktionelle Dimere sind EGFR/EGFR, EGFR/ERBB2,
EGFR/ERBB3 sowie ERBB2/ERBB3.
In biologischen Systemen werden extrazelluläre
Signale mit hoher Geschwindigkeit
weitervermittelt und in die zellulären
Abläufe integriert. Bei der Regulation des
physiologischen Gleichgewichtes spielen
unterschiedliche biochemische Vorgänge eine
Rolle, von denen viele über posttranslationale
Modifizierungen von Proteinen, wie etwa die
Phosphorylierung- und Dephosphorylierung
von Proteinen, vermittelt werden.
So werden membranständige Rezeptortyrosinkinasen
(RTK) durch das Andocken
spezifischer Liganden aktiviert, zum Beispiel
des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF).
Für die Weitervermittlung des Signals in die
Zelle muss der Rezeptor mit einer anderen RTK
dimerisieren (Abb. 1). In die Signalweitergabe
sind zahlreiche intrazelluläre Lipid- und Proteinkinasen
eingebunden. Rückkopplungsschleifen
sorgen gleichzeitig für eine Integration
der Information in parallel stattfindende
zelluläre Signalprozesse beziehungsweise
auch für ein Abschalten des Rezeptors.
Zahlreiche Tumoren produzieren anstelle
der normalen Version mutierte Varianten
einer bestimmten Rezeptortyrosinkinase, da
sie auf diese Weise einen Überlebensvorteil
gewinnen und ihre Zellteilung und somit auch
das Tumorwachstum vorantreiben können.
So sind für den Rezeptor des Epidermalen
Wachstumsfaktors (EGFR) verschiedene
aktivierende Mutationen beschrieben, die
Blitzlicht Microarrays
beispielsweise in Tumoren der Lunge identifiziert
wurden 1 . Eine andere erfolgreiche
Strategie von Tumoren für die Sicherung eines
schnelleren und nicht regulierten Wachstums
ist die verstärkte Expression eines bestimmten
Rezeptors. In vielen Tumoren der Brust
wird beispielsweise HER2, ein dem EGFR
strukturell verwandtes Membranprotein,
überproduziert. Im Gegensatz zu EGFR kann
HER2 auch ohne Andocken eines extrazellulären
Liganden sein wachstumsaktivierendes
Signal in die Zelle weitergeben und auf
diese Weise die Malignität eines Tumors
verstärken 2 . Gegen beide Rezeptoren wurden
gezielte Therapeutika entwickelt, die bereits
in der klinischen Anwendung sind 3 . In der
klinischen Praxis sind jedoch nur rund 30%
der gezielten Therapeutika wirksam, und in
vielen Fällen entwickeln Tumoren während
einer langfristigen Behandlung Resistenzen
gegen die Therapie. Offensichtlich verfügen
Tumoren über molekulare Mechanismen, die
es ihnen erlauben, die Wirkung der gezielten
Therapeutika zu umgehen.
Bislang sind die Mechanismen der intrazellulären
Regulationsprozesse jedoch nur unzureichend
verstanden, da viele Signalwege
durch Knotenpunkte miteinander verknüpft
sind und als komplexe Netzwerke fungieren.
Exakte zeitaufgelöste und quantitative Analysen
miteinander interagierender Signalwege
können jedoch hilfreiche Anhaltspunkte
zu zell- oder tumorspezifischen Regulationsvorgängen
liefern. In den vergangenen
Jahren wurden Protein-Microarrays als experimentelle
Plattform für quantitative und
dynamische Analysen des Phosphoproteoms
eingesetzt. Protein-Microarrays übertreffen
herkömmliche etablierte Methoden der
Proteomik im Hinblick auf ihre große Probenkapazität,
hohe Empfindlichkeit, sehr gute
Reproduzierbarkeit quantitativer Daten und
auch die Schnelligkeit der Analyse. So haben
sich Protein-Microarrays als sensitives und
effizientes Werkzeug für die Wirkstoffforschung
sowie die Untersuchung individueller
Tumorproben erwiesen. Insbesondere bieten
sie eine ideale Grundlage für die quantitative
und dynamische Analyse von Proteinkinasevermittelten
Signalprozessen
Reverse Phase Protein-Microarrays
In der Reverse Phase Protein Microarray-Technologie,
RPPA, werden die zu untersuchenden
Proben in genau definierten Positionen auf einem
Festphasenträger (Slide) aufgebracht. Die
Abgabe der Proben auf die Slides erfolgt mit
Hilfe eines sehr präzisen Roboters. Vergleichbar
zu den Positionen einer Mikrotiterplatte
lässt sich jede einzelne Position auf dem Slide
und damit auch jede Probe genau adressieren
(Abb. 2). In einem Druckvorgang können
mehrere Hundert identische Replikat-Slides
produziert werden. In den immobilisierten
LABORWElT 10. Jahrgang | Nr. 5/2009 | 29